ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

---

 

ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΕΣ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΕΣ

Κατιούσα επεξεργασία ενζύμων

Η άσκηση παρέχει τη δυνατότητα, χρησιμοποιώντας βασικές χρωματογραφικές και ηλεκτροφορητικές τεχνικές να γνωρίσετε τις αρχές της κατιούσας επεξεργασίας. Η άσκηση τρέχει από το πρόγραμμα ProteinLab, που έχει σχεδιαστεί από τον Dr. A. Booth, (Leeds University, UK).

 

Σενάριο: Βρίσκεστε σε ένα ερευνητικό εργαστήριο και σας έχουν αναθέσει να αναπτύξετε το πιο οικονομικό πρωτόκολλο καθαρισμού για ένα ένζυμο. Στο πρόγραμμα υπάρχουν αποθηκευμένα 20 διαφορετικά μίγματα πρωτεϊνών που μπορείτε να επιλέξετε και να σχεδιάσετε μια μέθοδο καθαρισμό για κάποιο από αυτά.

 

Εκτέλεση της Άσκησης:

Αρχικά ενεργοποιείστε το πρόγραμμα.

1. Από το menu επιλέξτε Begin και κατόπιν Start from beginning

 

2. Εμφανίζεται ένα παράθυρο με την ερώτηση: Start from stored material?, επέλεξε: No

 

3. Εμφανίζεται ένα παράθυρο με την ερώτηση: Which protein (1-20 ?). Επιλέξτε ένα από τα 20 μίγματα πρωτεϊνών που υπάρχουν αποθηκευμένα στο πρόγραμμα.

 

4. Το παράθυρο που εμφανίζεται μας παρέχει πληροφορίες σχετικά με τη σταθερότητα του ενζύμου έναντι θερμοκρασίας και pH.

 

5. Ακολούθως, από το menu επιλέξτε Separation. Μπορείτε να επιλέξετε μία από τις παρακάτω μεθόδους καθαρισμού:

·      Ammonium sulfate fractionation

·      Heat denaturation

·      Gel filtration

·      Ion exchange chromatography

·      Hydrophobic interaction chromatography

·      Preparative isoelectric focusing

·      Affinity chromatography

 

6. Ακολούθως στο παράθυρο που εμφανίζεται μπορείτε να επιλέξετε τις συνθήκες, κάτω από τις οποίες επιθυμείτε να πραγματοποιηθεί η μέθοδος καθαρισμού που έχετε επιλέξει.

 

7. Επιλέξτε Done.

 

8. Στο παράθυρο που εμφανίζεται, αν είχατε επιλέξει τις μεθόδους Ammonium sulfate fractionation ή Heat denaturation, δίνονται τα αποτελέσματα του καθαρισμού (ποσότητα πρωτεΐνης, ενζυμικές μονάδες, ανάκτηση, καθαρισμός). Αν είχατε επιλέξει κάποια από τις χρωματογραφικές μεθόδους όπως  gel filtration, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, preparative isoelectric focusing ή affinity chromatography, τότε εμφανίζεται το χρωματογράφημα καθαρισμού του ενζύμου (mg πρωτεΐνης που αντιστοιχούν σε κάθε κλάσμα)). Από το menu επιλέξτε Fractions και μετά Αssay enzyme activity. Στο χρωματογράφημα εμφανίζεται η ενζυμική δραστικότητα (ενζυμικές μονάδες έναντι αριθμού κλάσματος).

 

9. Από το menu επιλέξτε Fractions και μετά Pool fractions. Στο παράθυρο που εμφανίζεται δίνονται τα αποτελέσματα του καθαρισμού (ποσότητα πρωτεΐνης, ενζυμικές μονάδες, ανάκτηση, καθαρισμός).

 

10. Η πορεία καθαρισμού μπορεί να ελέγχεται ηλεκτροφορητικά. Από το menu επιλέξτε Electrophoresis. Εμφανίζεται το ηλεκτροφορητικό αποτύπωμα. Υπάρχουν δύο δυνατότητες χρώσης των πρωτεϊνικών ζωνών: με Coomassie Blue και ανοσοενζυμικά με τη χρήση αντισωμάτων. Από το menu επιλέξτε Electrophoresis, 1D gel, και μετά Stain. Αφού μελετήσετε το ηλεκτροφορητικό αποτύπωμα, επιλέξτε Finished και μετά Done with gel.

 

11. Εάν δεν έχει πραγματοποιηθεί ο επιθυμητός καθαρισμός, δηλαδή μπορεί να υπάρχουν ακόμα προσμίξεις από άλλες πρωτεΐνες, μπορείτε να συνεχίσετε τον καθαρισμό δοκιμάζοντας μια διαφορετική μέθοδο καθαρισμού. Από το menu μπορείται να επιλέξετε Separation και να εφαρμόσετε μια νέα μέθοδο.

 

12. Εάν κάποιο στάδιο καθαρισμού δεν σας ικανοποιεί τότε από το menu επέλεξτε Quit και μετά Abandon step and start again.

 

13. Η πορεία καθαρισμού του ενζύμου και το κόστος της διεργασίας παρέχεται εάν από το menu Help επιλέξετε Progress report.

 

14. Αφού ολοκληρώσετε την άσκηση μπορείται να την αποθηκεύσετε αν από το menu Quit επιλέξετε Go home. Στο παράθυρο που εμφανίζεται ‘Store your materials?’  επιλέξετε: Yes. Δώστε ένα όνομα στο αρχείο.

 

Σε όλη τη διάρκεια της άσκησης μπορείτε να παίρνετε από το menu Help θεωρητικές πληροφορίες σχετικά με τις μεθόδους καθαρισμού.