Οι δέκα εντολές της οπτικής μικροσκοπίας.

Κωνσταντίνος Φασσέας, Καθηγητής Γ.Π.Α.

            Είναι πολύ συνηθισμένο, στις μέρες μας να βλέπουμε σε περιοδικά βιβλία και εγκυκλοπαίδειες φωτογραφίες που αν και είναι τραβηγμένες με υπερσύγχρονα αυτόματα μικροσκόπια, είναι κακής ποιότητας.  Όπως όμως ένα καλό και ακριβό αυτοκίνητο δεν σε κάνει αυτόματα και καλό οδηγό έτσι και ένα καλό μικροσκόπιο για να δείξει τις δυνατότητές του πρέπει να χρησιμοποιηθεί σωστά.

1. Το προς παρατήρηση αντικείμενο πρέπει να είναι καθαρό, ειδικά η καλυπτρίδα δεν πρέπει να έχει δαχτυλιές και υπολείμματα από λάδι κατάδυσης.  Εξέταση της καλυπτρίδας με φως που αντανακλάται επάνω της θα μας δείξει τέτοιους ρύπους που επιδρούν σημαντικά στη ποιότητα της εικόνας.  Στα σύγχρονα ερευνητικά μικροσκόπια υπάρχουν πολύπλοκα συστήματα φωτισμού και συμπυκνωτών φακών που ενισχύουν αυτού του είδους τα σφάλματα.
2. Η καθαρότητα του αντικειμενικού φακού είναι συχνά πιο σημαντική από την ποιότητά του.  Ενα μικρό ίχνος λαδιού σ'ένα στεγνό επίπεδο-αποχρωματικό αντικειμενικό φακό, μειώνει την ικανότητά του σ'εκείνη ενός καθαρού αχρωματικού.  Το ίδιο συμβαίνει και με ένα αρύθμιστο συμπυκνωτή φακό.
3. Οι αντικειμενικοί φακοί έχουν διάφορα αριθμητικά ανοίγματα που σχετίζονται με την εστιακή τους απόσταση και το βαθμό διόρθωσης που κάνουν στα οπτικά σφάλματα (σφαιρικά ή χρωματικά).  Έχουν καλύτερη απόδοση όταν το διάφραγμα του συμπυκνωτή φακού, είναι λίγο μικρότερο από τη διάμετρο του φωτεινού κώνου που μπορεί να δεχτεί ο αντικειμενικός φακός.  Αυτή η ρύθμιση γίνεται με την ίριδα του συμπυκνωτή φακού.  Αυτό στη πράξη απλά μπορεί να γίνει αν βγάλουμε το προσοφθάλμιο φακό και κοιτάζοντας μέσα στο σωλήνα, κλείσουμε την ίριδα έτσι που να σκεπαστεί περίπου το 1/3 - 1/4 της διαμέτρου του φωτεινού δίσκου που βλέπουμε μέσα στο σωλήνα.  Αυτή η τεχνική θα δώσει καλό αποτέλεσμα σε ένα χρωματισμένο παρασκεύασμα με σχετικά καλή αντίθεση.  Όταν η ίριδα είναι πολύ ανοιχτή μειώνεται η αντίθεση.  Μικρότερη ίριδα προκαλεί διάθλαση και περίθλαση του φωτός με αποτέλεσμα την αύξηση μεν της αντίθεσης αλλά τη χειροτέρευση της διακριτικής ικανότητας και παραμόρφωση της εικόνας.  Αυτό όμως πολλές φορές είναι αναπόφευκτο όταν θέλουμε να παρατηρήσουμε παρασκευάσματα αχρωμάτιστα που από τη φύση τους έχουν χαμηλή αντίθεση όπως π.χ. αχρωμάτιστα ζωικά κύτταρα.

4. Ένα σωστά ρυθμισμένο σύστημα φωτισμού Köhler εξασφαλίζει καλή αντίθεση επειδή φωτίζεται μόνο η περιοχή του παρασκευάσματος που παρατηρούμε και έτσι δεν υπάρχουν «αδέσποτες» φωτεινές ακτίνες.  Αυτό το σύστημα φωτισμού δίνει καλύτερη εικόνα όσον αφορά στην αντίθεση, δεν υπάρχει όμως διαφορά στη διακριτική ικανότητα συγκρινόμενο με το απλό σύστημα φωτισμού όπου εστιάζεται η σημειακή πηγή.
5. Τα σύγχρονα μικροσκόπια διαθέτουν ισχυρά φωτιστικά συστήματα χαμηλής τάσης.  Η ένταση του φωτός που παρατηρούμε μέσα στο μικροσκόπιο πρέπει να συγκρίνεται με εκείνη του φωτός ημέρας.  Χαμηλή φωτεινή ένταση δε δείχνει όλες τις λεπτομέρειες του παρασκευάσματος ενώ πολύ δυνατή ένταση πρέπει να αποφεύγεται για προφανείς λόγους.  Μείωση της φωτεινότητας ελαττώνοντας τη τάση του ρεύματος έχει σαν αποτέλεσμα τη μείωση της θερμοκρασίας του νήματος της λάμπας και τη παραγωγή ερυθρής και υπέρυθρης ακτινοβολίας.  Αυτό κυρίως επηρεάζει τη φωτογράφηση (όταν το film είναι έγχρωμο), αλλά και τη διακριτική ικανότητα του μικροσκοπίου αφού αυτή είναι συνάρτηση του μήκους κύματος του φωτός που χρησιμοποιείται.  Για τους λόγους αυτούς για τη μείωση του φωτισμού συνιστάται η χρήση ουδέτερων (γκρι) φίλτρων και ποτέ το κλείσιμο της ίριδας.
6. Ακόμα και σε μια πολύ «ζεστή» λάμπα αλογόνου 12 V 100 W η ενέργεια που μετατρέπεται σε φως είναι ελάχιστη.  Το μεγαλύτερο μέρος της παραγόμενης ακτινοβολίας είναι με τη μορφή θερμότητας όπως η υπέρυθρη, ενώ και στο ορατό φάσμα κυριαρχεί το κόκκινο.  Επομένως παρατήρηση ή φωτογράφηση με «κοινό» φωτισμό σημαίνει κυρίως «κόκκινες εικόνες».  Αυτό μπορεί να διορθωθεί με τη χρήση φίλτρων συμβολής χρώματος κίτρινου-πράσινου με μέγιστη διαπερατότητα γύρω στα 550 nm.  Αυτά τα φίλτρα ενισχύουν την αντίθεση με τις περισσότερες χρωστικές «ρουτίνας» και πολύ καλύτερα από τα συνηθισμένα μπλε φίλτρα φωτός ημέρας που αφαιρούν ένα σημαντικό μέρος του φωτός από τη μέση του φάσματος.  Άλλος τρόπος αντιμετώπισης του προβλήματος είναι η χρησιμοποίηση film τεχνητού φωτισμού (films που έχουν την ένδειξη «tungsten» γραμμένη στη συσκευασία).  Με την ψηφιακή φωτογράφιση αυτά διορθώνονται μέσω των προγραμμάτων.
7. Επιλογή αντικειμενικού φακού.  Ούτε ο μέγιστος βαθμός διόρθωσης αλλά ούτε η μεγαλύτερη δυνατή διακριτική ικανότητα είναι πάντα αυτό που ζητάμε.  Συχνά οι φακοί μ’ αυτά τα προσόντα έχουν πολύ μικρή απόσταση εργασίας.  Ενας φακός με χαρακτηριστικά 100Χ και α.α.=1.3 ελαιοδυτικός, για να αποδώσει σωστά χρειά-ζεται τομές πάχους το πολύ 6μm ενω το βάθος εστίασής του είναι λιγώτερο απο 1μm που σημαίνει ότι  τμήματα του παρασκευάσματος εκτός εστίασης μειώνουν αισθητά τις δυνατότητες του φακού.  Στην ίδια όμως τελική μεγέθυνση και με καλύτερα αποτελέσματα μπορούμε να φτάσουμε με λιγότερο ισχυρό φακό με χαμηλότερο α.α. (που σημαίνει μεγαλύτερο βάθος εστίασης) και μεγεθύνοντας λίγο περισσότερο τη φωτογραφία.  Οι περισσότεροι κατασκευαστές μικροσκοπίων σήμερα παράγουν φακούς ελαιοκαταδυτικούς αντικειμενικούς zoom Χ50-63 (με α.α. 1.10-1.25) που προτιμούνται από τους παραδοσιακούς Χ100 με α.α. 1.3, εκτός αν παρατηρούμε λεπτά επιχρίσματα ή πλαστικές τομές πάχους λεπτότερες του 1 μm.  Αυτοί οι Χ50-63 επισκιάζουν κατά πολύ τους κλασσικούς ξερούς φακούς αντίστοιχης μεγέθυνσης επειδή δεν επηρεάζονται από τα σφάλματα που προκαλούνται από τις «αδέσποτες» φωτεινές ακτίνες.
8. Οι σύγχρονοι προσοφθάλμιοι φακοί προσφέρουν πιο άνετη παρατήρηση ακόμα και σ’ εκείνους που φοράνε γυαλιά επειδή το μάτι εστιάζει πιο μακριά από το φακό και έχει μεγαλύτερο οπτικό πεδίο από εκείνο των φακών Huygens ή Ramsden.
9. H ενδιάμεση εικόνα που περιέχει όλες τις λεπτομέρειες που έχουν παραχθεί από τον αντικειμενικό φακό εστιάζεται και μεγεθύνεται από τον προσοφθάλμιο έτσι που να φαίνεται καλά με το ανθρώπινο μάτι.  Για άνετη παρατήρηση, ο προσοφθάλμιος σε σχέση με το μάτι πρέπει να ρυθμίζεται έτσι που το είδωλο να φαίνεται ότι βρίσκεται σε μια απόσταση 2-4 m.
10. Μια μικροφωτογραφία δε μπορεί ποτέ να βελτιώσει την εικόνα που φαίνεται με το μάτι (εκτός από ειδικές περιπτώσεις πολύ χαμηλού φωτισμού).  Από την άλλη πλευρά μικροφωτογραφίες που απογοητεύουν, συχνά είναι αποτέλεσμα υποτίμησης των ικανοτήτων του ανθρώπινου συστήματος μάτι - εγκέφαλος που έχει την ικανότητα να αντισταθμίζει τον ανομοιόμορφο φωτισμό ή τη σφαιρικότητα της της εικόνας.  Αυτές όμως οι ατέλειες εμφανίζονται στη φωτογραφία και εδώ η μόνη λύση είναι καλής ποιότητας αντικειμενικοί φακοί με καλές διορθωτικές ικανότητες.