1.     OΠΤΙΚΑ (ΦΩΤΟΝΙΚΑ) ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ.  ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ.

Κωνσταντίνος Φασσέας, Καθηγητής Γ.Π.Α.

 

            Ως Οπτικά ή Φωτονικά αναφέρονται τα μικροσκόπια εκείνα που χρησιμοποιούν το τμήμα του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος που είναι ορατό, δηλαδή από 380 - 760 nm.  Ανάλογα με τη διάταξη των φακών και τον τρόπο παρατήρησης τα οπτικά μικροσκόπια διακρίνονται σε μικροσκόπια φωτεινού πεδίου, σκοτεινού πεδίου, αντίθεσης φάσεως, κλπ που αναφέρονται στη συνέχεια.

            Η μεγέθυνση ενός οπτικού μικροσκοπίου δίνεται από το τύπο Μ=m₁*m₂ όπου m₁ και m₂ είναι οι εγκάρσιες μεγεθύνσεις των δυο φακών, δηλαδή του προσοφθάλμιου και του αντικειμενικού.  Επομένως θα μπορούσαμε να πούμε ότι βάζοντας δυνατότερους φακούς θα ήταν δυνατό να πετύχουμε μεγαλύτερες μεγεθύνσεις.

            Πράγματι μ' αυτό το σκεπτικό θα βλέπαμε το παρασκεύασμά μας μεγαλύτερο χωρίς όμως να έχουμε πιο μεγάλη ευκρίνεια της εικόνας ("άδεια μεγέθυνση"), όπως ακριβώς συμβαίνει όταν μεγεθύνουμε πολύ μια φωτογραφία έτσι που να φαίνονται οι κόκκοι του film.  Υπάρχει μ' άλλα λόγια μια μέγιστη χρήσιμη μεγέθυνση που είναι συνάρτηση της διακριτικής ικανότητας του οργάνου που ορίζεται ως η ικανότητά του να διακρίνει δυο σημειακές φωτεινές πηγές που βρίσκονται πολύ κοντά η μια με την άλλη.

 

Η διακριτική ικανότητα (d) ενός οπτικού συστήματος δίνεται από το τύπο:    

 

                                                                 [1]

 όπου d  είναι η διακριτική ικανότητα, 0.61 ένας σταθερός αριθμός, λ το μήκος κύματος του φωτός (ή της ακτινοβολίας) που χρησιμοποιούμε, n ο δείκτης διάθλασης του μέσου μεταξύ παρασκευάσματος και φακού και α το μισό της γωνίας του φωτεινού κώνου που δέχεται ο φακός.

Η συνάρτηση [2] λέγεται και αριθμητικό άνοιγμα (Α) του φακού και εξαρτάται αποκλειστικά από τη κατασκευή του φακού.

                                                         

 

                                                                   [2]

            Εφ' όσο λοιπόν το φως που χρησιμοποιούν τα οπτικά μικροσκόπια συνήθως έχει ένα μέσο μήκος κύματος λ=500 nm και το αριθμητικό άνοιγμα (Α) ενός πολύ καλού φακού είναι 1.6, τότε η διακριτική ικανότητα του οπτικού μικροσκοπίου δε μπορεί να ξεπεράσει τα d=200 nm=0.2 μm και η "χρήσιμη μεγέθυνση" περίπου τη τιμή 1600Χ.  Ένας πρόχειρος, πρακτικός τρόπος υπολογισμού της "χρήσιμης μεγέθυνσης" που μπορεί να μας δώσει ένας αντικειμενικός φακός, δίνεται από το τύπο χ.μ.=1000*Α.   Ο τύπος λοιπόν [1] μας λέει πως για να καλυτερέψουμε τη διακριτική ικανότητα θα πρέπει να μικρύνουμε το λ και να αυξήσουμε το Α.  Επειδή όμως οι οπτικοί (γυάλινοι) φακοί, από πλευράς ποιότητας κατασκευής, είναι σχεδόν τέλειοι, το Α δε μπορεί να αυξηθεί άλλο.  Έτσι μας μένει μόνο το μήκος κύματος του φωτός (ή της ακτινοβολίας) το οποίο όμως όταν μικρύνει πολύ γίνεται αόρατο!   Κατά καιρούς γίνανε διάφορες προσπάθειες βελτίωσης της διακριτικής ικανότητας του μικροσκοπίου χρησιμοποιώντας ακτινοβολίες με μήκος κύματος μικρότερο εκείνου του ορατού φωτός με αποτέλεσμα τη κατασκευή διαφόρων τύπων μικροσκοπίων όπως το υπεριώδες μικροσκόπιο,  το μικροσκόπιο ακτινών Χ και άλλων μεταξύ των οποίων και το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο στις διάφορες παραλλαγές του.

            Στη πράξη τα μικροσκόπια που συναντάμε συνήθως σ’ ένα εργαστήριο έχουν φακούς που στη καλύτερη περίπτωση έχουν αριθμητικό άνοιγμα Α = 1.4.  Οι φακοί με μεγαλύτερο αριθμητικό άνοιγμα (Α = 1.6) έχουν δυο μεγάλα μειονεκτήματα, τη πολύ υψηλή τιμή αγοράς αλλά και το πολύ μικρό βάθος εστίασης, κάτι που τους κάνει ιδιαίτερα δύσχρηστους.

 

1.1       Κοινό σύνθετο οπτικό μικροσκόπιο διελεύσεως.                                                                                       

            Η πρόοδος της ηλεκτρονικής και των μικροϋπολογιστών δεν άφησε ανέπαφη και τη μικροσκοπία.  Τα σύγχρονα οπτικά μικροσκόπια διαθέτουν πλήθος αυτοματισμών και άλλων μηχανισμών που κάνουν τα μικροσκόπια πιο εύκολα στη χρήση ακόμα και από άτομα χωρίς ειδικές γνώσεις.  Η χρήση όμως αυτών των μικροσκοπίων περιορίζεται σχεδόν αποκλειστικά στην έρευνα και τη διάγνωση στην ιατρική λόγω μεγάλου κόστους αγοράς και συντήρησης.  Έτσι θεωρώ σκόπιμο εδώ να δώσω μια σύντομη περιγραφή των τμημάτων ενός απλού μικροσκοπίου που θα χρησιμοποιούμε για πολλά ακόμα χρόνια (Εικόνα 2)  Στην Εικόνα 1 φαίνεται σχηματικά η πορεία των φωτεινών ακτίνων στο σύνθετο οπτικό μικροσκόπιο.

 

Προσοφθάλμιος φακός, τοποθετημένος στο πάνω μέρος του σωλήνα.  Υπάρχουν τέσσερις τύποι: Huygens, Ramsden, Kellner και αντισταθμιστικοί (compensating).  Οι τελευταίοι είναι και οι πιο σύγχρονοι και επιτρέπουν την παρατήρηση χωρίς το μάτι να είναι σε επαφή με φακό. Ο χαραγμένος αριθμός π.χ. 10Χ δείχνει τη μεγέθυνση του φακού που αν τον πολλαπλασιάσουμε με τη μεγέθυνση του αντικειμενικού φακού μας δίνει την τελική μεγέθυνση του μικροσκοπίου.  Σε όλους σχεδόν τους προσοφθάλμιους φακούς υπάρχει δυνατότητα τοποθέτησης κλίμακας μέτρησης μέσα στο φακό αφού τον ξεβιδώσουμε.  Ο  σωλήνας στην κορυφή του οποίου βρίσκεται ο προσοφθάλμιος φακός (κατακόρυφος στα παλιότερα μικροσκόπια και υπό γωνία στα πιο σύγχρονα), μπορεί να είναι μονός, στα μονοφθάλμια μικροσκόπια και διπλός στα διοφθάλμια για πιο άνετη (όχι στερεοσκοπική) παρατήρηση.  Ο σωλήνας συνήθως μπορεί να αφαιρεθεί για να τοποθετηθεί σωλήνας άλλου τύπου π.χ. σωλήνας με υποδοχή για φωτογραφική μηχανή video camera κλπ, ή να περιστραφεί για χρήση του μικροσκοπίου από εμπρός ή από πίσω.

 

Περιστρεφόμενη κεφαλή με τους αντικειμενικούς φακούς.  Συνήθως έχει θέσεις για 3 - 6 φακούς.  Σε ορισμένα ερευνητικά μικροσκόπια η περιστρεφόμενη κεφαλή μπορεί να αφαιρεθεί εύκολα και να αντικατασταθεί με άλλη που έχει διαφορετικό set φακών.  Έτσι σχετικά εύκολα μπορεί το μικροσκόπιο να μετατραπεί σε αντίθεσης φάσης, φθορισμού κλπ.  Οι  αντικειμενικοί φακοί είναι τα πιο σημαντικά εξαρτήματα του συστήματος σχηματισμού εικόνας του μικροσκοπίου γιατί από αυτούς εξαρτάται η τελική διακριτική ικανότητα και η αρχική μεγέθυνση.  Οι φακοί αυτοί έχουν κατασκευαστεί έτσι που οι εικόνες να μην έχουν σφαιρικά ή χρωματικά σφάλματα, και να μην έχουν αστιγματισμό.  Ο φακοί αυτοί  έχουν χαραγμένες στο σώμα τους διάφορες ενδείξεις π.χ.  Plan 40/0.65  160/0.17, που σημαίνει φακός επίπεδος μεγέθυνσης 40Χ, αριθμητικό άνοιγμα 0.65, για χρήση σε μικροσκόπιο με σωλήνα μήκους 160 mm, και με καλυπτρίδα πάχους 0.17+0.01 mm.   Η ένδειξη d=0 σημαίνει ότι ο φακός είναι σχεδιασμένος για να χρησιμοποιείται χωρίς καλυπτρίδα.  Επειδή οι διάφοροι κατασκευαστές μικροσκοπίων μπορεί να χρησιμοποιούν διαφορετικούς συμβολισμούς θα πρέπει πάντα να διαβάζουμε τις οδηγίες χρήσης του συγκεκριμένου οργάνου.  Το χρώμα των γραμμάτων και συμβόλων που είναι χαραγμένα πάνω στον αντικειμενικό φακό επίσης είναι ενδεικτικά του οπτικού τύπου του φακού π.χ. κόκκινα γράμματα συμβολίζουν φακό για πολωμένο φως ενώ πράσινα γράμματα συμβολίζουν φακό αντίθεσης φάσης.  Πολλές φορές ο τύπος του φακού και η μεγέθυνσή του συμβολίζονται και με χρωματιστά δαχτυλίδια χαραγμένα πάνω τους όπως αναφέρεται στον πιο κάτω Πίνακα 1.

 

                      

Μεγέθυνση	Χρώμα
1-1.25	μαύρο
1.6-2	γκρι
2.5-3.2	καφέ
4-5	κόκκινο
6.3-8	πορτοκαλί
10-12.5	κίτρινο
16-20	ανοιχτό πράσινο
25-32	σκούρο πράσινο
40-50	ανοιχτό μπλε
63-80	σκούρο μπλε
100, 125, 160	άσπρο
Υ  Υγρό κατάδυσης φακού		Χρώμα
λάδι		μαύρο
νερό		άσπρο
γλυκερίνη		πορτοκαλί
άλλα υγρά		κόκκινο

 

 

Άλλα σύμβολα που μπορεί να είναι χαραγμένα πάνω στους αντικειμενικούς φακούς:

PH: φακός για διάταξη αντίθεσης φάσης, ο αριθμός που συνήθως ακολουθεί π.χ. ΡΗ2 σημαίνει ότι ο φακός αυτός πρέπει να χρησιμοποιηθεί σε συνεργασία με το διάφραγμα νούμερο 2 του συμπυκνωτή φακού.

PLAN: σημαίνει ότι ο φακός είναι επίπεδος, δηλαδή όλα τα σημεία του οπτικού πεδίου εστιάζουν στο ίδιο επίπεδο, αντίθετα σε φακούς χωρίς αυτή την ένδειξη όταν το κέντρο του οπτικού πεδίου είναι εστιασμένο τα σημεία στην περιφέρεια δεν είναι εστιασμένα.  Είναι απαραίτητο να χρησιμοποιούνται τέτοιοι φακοί όταν πρόκειται να γίνει φωτογράφηση του παρασκευάσματος.

APO: σημαίνει ότι ο φακός είναι αποχρωματικός, δηλαδή τα χρωματικά σφάλματα του φακού έχουν ελαχιστοποιηθεί για τρία τουλάχιστον μήκη κύματος  (450, 550 και 650 nm) ενώ τα σφαιρικά σφάλματα έχουν ελαχιστοποιηθεί για μήκος κύματος περίπου 550 nm.

Achromat: λίγο κατώτερης ποιότητας από τους φακούς ΑΡΟ γιατί τα χρωματικά σφάλματα είναι ελαχιστοποιημένα για δυο μόνο μήκη κύματος (περίπου 500 και 600 nm) ενώ η διόρθωση για σφαιρικά σφάλματα είναι η ίδια με εκείνη των φακών ΑΡΟ.

POL: σημαίνει ότι ο φακός είναι για πολωτικό μικροσκόπιο.

Semi-apochromat: φακοί ποιότητας ενδιάμεσης μεταξύ του APO και του Achromat.

Fluorite, Neofluor: σημαίνει ότι το γυαλί από το οποίο είναι κατασκευασμένος ο φακός δεν απορροφά την υπεριώδη ακτινοβολία και δεν φθορίζει.  Αυτοί οι φακοί είναι κατάλληλοι φια μικροσκοπία φθορισμού ενώ μπορούν να χρησιμοποιηθούν και με κοινό φωτισμό.

 

Η τράπεζα του μικροσκοπίου που μπορεί να είναι τετράγωνη σταθερή ή στρογγυλή περιστρεφόμενη (για πολωτικά μικροσκόπια) και με σύστημα μικρομετρικών κοχλιών για τη μετακίνηση του παρασκευάσματος.  Το υλικό κατασκευής της τράπεζας είναι συνήθως κάποιο μέταλλο ενώ σε κάποια σύγχρονα καλά μικροσκόπια μπορεί να είναι από κεραμικό που είναι ανθεκτικό σε διάφορες διαβρωτικές ουσίες.  Σε ορισμένα μικροσκόπια  υπάρχει μηχανισμός αυτόματης μετακίνησης της αντικειμενοφόρου πλάκας με δυνατότητα συστηματικής σάρωσής της ή και ακόμα με τη δυνατότητα εναλλαγής αντικειμενοφόρων πλακών.  Τα συστήματα αυτά είναι ιδιαίτερα χρήσιμα σε αυτοματοποιημένες αιματολογικές και κυτταρολογικές εξετάσεις και βιοψίες.

 

4.  Μοχλός ρύθμισης της ίριδας (διαφράγματος).  Η ίριδα περιορίζει τον φωτεινό κώνο που φωτίζει το παρασκεύασμα έτσι που αυτό να δέχεται τις ακτίνες που δεν προέρχονται από περίθλαση ή διάθλαση.  Η ίριδα δεν πρέπει ποτέ να χρησιμοποιείται για την αύξηση ή ελάττωση της φωτεινής έντασης.  Η ρύθμισή της είναι πολύ σημαντική κυρίως όταν πρόκειται να φωτογραφίσουμε το παρασκεύασμα.  Ο τρόπος ρύθμισης διαφέρει από κατασκευαστή σε κατασκευαστή και θα πρέπει πάντα να συμβουλευόμαστε τις οδηγίες χρήσης του οργάνου.

 

 

5.  Συγκεντρωτής (ή συμπυκνωτής) φακός.  Σκοπός του εξαρτήματος αυτού είναι η εστίαση της φωτεινής πηγής στο επίπεδο του παρασκευάσματος.  Η κακή ρύθμιση του συμπυκνωτή έχει σαν αποτέλεσμα τον κατά πολύ περιορισμό της διακριτικής ικανότητας του οργάνου.  Για συνεχή παρατήρηση σε χαμηλή μεγέθυνση (π.χ. 4Χ ή 10Χ) ο φακός αυτός μπορεί να αφαιρεθεί.

6. Κουμπί εστίασης (μεγάλο εξωτερικό για αδρή και μικρό στο κέντρο για λεπτή εστίαση).  Σε πολλά μικροσκόπια υπάρχουν ξεχωριστά αυτοί οι δυο κοχλίες.  Η κλίμακα που είναι χαραγμένη στο μικρομετρικό κοχλία εστίασης μας δείχνει την κατακόρυφη μετακίνηση του αντικειμενικού φακού και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση του ύψους (βάθους) ενός παρασκευάσματος.

Βάση μικροσκοπίου με (συνήθως) ενσωματωμένο σύστημα φωτισμού.  Στα περισσότερα μικροσκόπια σήμερα υπάρχει ρεοστάτης για τη ρύθμιση της έντασης του φωτός.  Προσοχή όμως γιατί αλλάζοντας τη φωτεινή ένταση με αυτόν τον τρόπο αλλάζουν και τα μήκη κύματος που απαρτίζουν το φως.  Αυτό δεν επηρεάζει την απλή παρατήρηση ή την ασπρόμαυρη  φωτογράφηση, επηρεάζει όμως σημαντικά την έγχρωμη φωτογράφηση.  Στην τελευταία περίπτωση χρησιμοποιούμε τον φωτισμό στη μέγιστη ένταση και για τον περιορισμό της φωτεινής έντασης χρησιμοποιούμε ουδέτερα φίλτρα.

 

            Επειδή κάθε μικροσκόπιο έχει και κάποιες ιδιαιτερότητες συνιστάται πάντοτε να ακολουθούνται πιστά οι οδηγίες χρήσης που συνοδεύουν το όργανο, για καλύτερα αποτελέσματα και κυρίως όταν θέλουμε να φωτογραφίσουμε το παρασκεύασμα, αλλά και για τη προστασία του μικροσκοπίου από τυχόν κακούς χειρισμούς.

 

1.2     Μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου (dark field).

            Αυτό το μικροσκόπιο είναι ίδιο με το φωτεινού πεδίου με μόνη διαφορά ότι στο συγκεντρωτή φακό υπάρχει ένας αδιαφανής δίσκος που σκεπάζει το κέντρο του φακού με αποτέλεσμα το παρασκεύασμα να φωτίζεται μόνο από πολύ πλάγιες ακτίνες που δεν εισέρχονται στον αντικειμενικό φακό παρά μόνο αν υποστούν διάθλαση μέσα στο παρασκεύασμα.  Έτσι η εικόνα που παρατηρούμε είναι φωτεινό αντικείμενο (από διάθλαση των ακτινών μέσα στο παρασκεύασμα) σε σκοτεινό πεδίο. Η πορεία των ακτινών φαίνεται στην Εικόνα 3.  Αυτό το είδος μικροσκοπίου συνιστάται για τη παρατήρηση μονοκύτταρων οργανισμών που θέλουμε να τους παρατηρήσουμε ζωντανούς ή/και αχρωμάτιστους. Σήμερα τα μικροσκόπια αυτά έχουν επισκιαστεί από τα μικροσκόπια αντίθεσης φάσης.

 

1.3     Mικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (phase contrast).

             Η πορεία των φωτεινών ακτινών σ' ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης φαίνεται στην Εικόνα 4.  Εδώ το παρασκεύασμα φωτίζεται από ένα κενό φωτεινό κώνο.  Αυτός ο φωτεινός κώνος παράγεται από το δακτύλιο φάσης που βρίσκεται στο επίπεδο της ίριδας του συγκεντρωτή φακού και ο οποίος είναι ορατός μέσα από τον αντικειμενικό φακό όταν ο δακτύλιος είναι σωστά ρυθμισμένος.

Αν στο επίπεδο της εστιακής απόστασης του αντικειμενικού φακού τοποθετηθεί η πλάκα φάσης, που καθυστερεί τις ακτίνες κατά 1/4 του μήκους κύματος σε σχέση με τις απ’ ευθείας φωτεινές ακτίνες, τότε σχηματίζεται μια εικόνα από την αντίθεση που παράγεται από τη συμβολή των δυο φωτεινών ακτίνων.  Η ρύθμιση του δακτυλίου και της πλάκας φάσης για κάθε αντικειμενικό φακό είναι απαραίτητο να γίνεται με πολύ σχολαστικότητα για να έχουμε καλή εικόνα αλλιώς η εικόνα είναι ένας απαράδεκτος συνδυασμός σκοτεινού πεδίου και αντίθεσης φάσης.  Θετική λέμε την αντίθεση που το αντικείμενο φαίνεται φωτεινό σε σκοτεινό πεδίο ενώ το αντίθετο, που είναι και το πιο συνηθισμένο, το λέμε αρνητική αντίθεση.

Για σωστή παρατήρηση το παρασκεύασμα πρέπει να τοποθετηθεί για παρατήρηση σε μέσο με δείκτη διάθλασης όσο γίνεται πιο διαφορετικό από εκείνο του παρασκευάσματος.  Αν ο δείκτης διάθλασης είναι ο ίδιος το παρασκεύασμα δε θα φαίνεται καθόλου!

 

Αυτός ο τύπος μικροσκοπίας είναι πολύ χρήσιμος κυρίως για τη παρατήρηση μονοκύτταρων οργανισμών, μικροοργανισμών, φυκών, μυκήτων, κυτταροκαλλιεργειών, κλπ. που θέλουμε να τα παρατηρήσουμε ζωντανά.  Δε συνιστάται για τη παρατήρηση μονιμοποιημένων και χρωματισμένων τομών ιστών, εκτός από ορισμένες περιπτώσεις όπως είναι η συστηματική ταξινόμηση γυρεοκόκκων

            Οι αντικειμενικοί φακοί αυτών των μικροσκοπίων έχουν χαραγμένα τα χαρακτηριστικά π.χ. Ph 2 ή Ph 3 που σημαίνει ότι ο φακός είναι για μικροσκοπία αντίθεσης φάσης με αντίστοιχο δαχτυλίδι συγκεντρωτή Νο 2 ή Νο 3.

 

1.4       Πολωτικό μικροσκόπιο (polarised).

            Είναι ένα απλό μικροσκόπιο στο οποίο όμως το παρασκεύασμα φωτίζεται με πολωμένο φως.  Το αποτέλεσμα είναι να μπορούμε να παρατηρήσουμε παρασκευάσματα που έχουν διαφορετική διαπερατότητα στο πολωμένο φως λόγω φαινομένων οπτικής ανισοτροπίας.  Τα μικροσκόπια αυτά είναι χρήσιμα κυρίως για τη παρατήρηση τροφίμων  (βλέπε Κεφ.  Μικροσκοπία τροφίμων), ορυκτών και γενικά παρασκευασμάτων που μας ενδιαφέρει η κρυσταλλική τους δομή.   Χαρακτηριστικό των μικροσκοπίων αυτών είναι η κυκλική τράπεζα που μπορεί να περιστραφεί κατά 360⁰ ενώ οι φακοί τους έχουν χαραγμένη τη λέξη "POL".

1.5       Μικροσκόπιο αντίθεσης διαφορικής συμβολής (differential interference contrast, Nomarski).

            Το είδος αυτής της μικροσκοπίας βρίσκει περιορισμένες εφαρμογές συνήθως στη παρατήρηση κυτταρικών οργανιδίων χωρίς χρώση και οι εικόνες που βλέπουμε έχουν μια χαρακτηριστική ανάγλυφη εμφάνιση σε τόνους του γκρι.         Είναι ένα είδος διαφορικής συμβολής χρησιμοποιώντας ειδικά πολωτικά πρίσματα τοποθετημένα σύμφωνα με τη σχεδίαση Nomarski.  Αυτό το μικροσκόπιο αποτελεί εξέλιξη του μικροσκοπίου συμβολής ή συμβολομετρίας που η μόνη χρήση του ήταν η μέτρηση του όγκου κυττάρων και κυτταρικών οργανιδίων.

 

1.6       Μικροσκόπιο φθορισμού (fluorescent).

            Φθορισμός είναι το φαινόμενο κατά το οποίο ορισμένα σώματα εκπέμπουν φως όταν αυτά διεγείρονται από κάποια ακτινοβολία.  Η εκπομπή φωτός σταματάει αμέσως με τη παύση της διεγείρουσας ακτινοβολίας.

            Μικροσκοπία φθορισμού είναι η μελέτη ουσιών που μπορούν να διεγερθούν και να φθορίσουν.  Αν και είναι αρκετές δεκαετίες από τότε που πρωτοχρησιμοποιήθηκαν αυτά τα μικροσκόπια, τα τελευταία χρόνια η χρήση τους έχει δώσει μια νέα ώθηση στις επιστήμες που τα χρησιμοποιούν.

            Το μήκος κύματος της ακτινοβολίας που παράγεται (φθορισμός) είναι μεγαλύτερο από εκείνο της διεγείρουσας ακτινοβολίας (νόμος του Stokes).  Επομένως μια φθορίζουσα ουσία μπορεί να διεγερθεί με μια ακτινοβολία της περιοχής του υπεριώδους που είναι αόρατη και να παραχθεί μια ακτινοβολία που να είναι ορατή.

            Το φαινόμενο αυτό χρησιμοποιείται στη μικροσκοπία φθορισμού για τη παρατήρηση ουσιών ή κυτταρικών δομών που είτε φθορίζουν από τη φύση τους είτε γίνονται φθορίζουσες με τη χρήση χημικών ουσιών, "χρωστικών", που φθορίζουν.

Υπάρχουν στη φύση ουσίες που έχουν την ιδιότητα να φθορίζουν όπως είναι η χλωροφύλλη, μερικά έλαια και κηροί.   Αυτές οι ουσίες λέμε ότι εμφανίζουν "πρωτογενή φθορισμό" ή "αυτοφθορισμό". Οι περισσότερες όμως ουσίες ή κυτταρικές δομές που μας ενδιαφέρουν επιστημονικά δεν εμφανίζουν "πρωτογενή φθορισμό".  Έτσι αυτά τα παρασκευάσματα θα πρέπει να χρωματισθούν για να μας δώσουν "χρήσιμο" φθορισμό.  Στόχος μας είναι ο φθορισμός ορισμένων μόνο περιοχών, ουσιών ή οργανιδίων των παρασκευασμάτων.

            Ο εξειδικευμένος αυτός φθορισμός μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση φθοριοχρωμάτων.  Οι ουσίες αυτές χρησιμοποιούνται όπως ακριβώς και οι συνηθισμένες ιστολογικές χρωστικές.  Ο φθορισμός που παρατηρείται στα παρασκευάσματα που έχουν χρωσθεί με φθοριοχρώματα αναφέρεται ως "δευτερογενής φθορισμός".

            Όταν το φθοριόχρωμα έχει συνδεθεί με κάποιο αντίσωμα που στη συνέχεια συνδέεται με το αντιγόνο και έτσι κάνει το τελευταίο ορατό, τότε η τεχνική αναφέρεται σαν ανοσοφθορισμός (Εικόνα Σφάλμα! Άγνωστη παράμετρος αλλαγής.).  Η τεχνική αυτή, αν και όχι τόσο νέα, επινοήθηκε το 1950 από τους Coons και Kaplan,  τα τελευταία χρόνια έχει αποκτήσει ιδιαίτερο ενδιαφέρον στις βιοϊατρικές επιστήμες κυρίως για διαγνωστικούς σκοπούς, λόγω της δημιουργίας καθαρών και μονοκλωνικών αντισωμάτων. 

                                                         

Μια παραλλαγή της μεθόδου του ανοσοφθορισμού είναι και η τεχνική sandwich όπου το φθοριόχρωμα είναι ήδη συνδεδεμένο με ένα δευτερογενές αντίσωμα το οποίο στη συνέχεια προσκολλάται στο σύμπλοκο αντιγόνο / πρωτογενές αντίσωμα. (Εικόνα 6).

            Από πλευράς κατασκευής το μικροσκόπιο φθορισμού είναι ένα κοινό μικροσκόπιο στο οποίο όμως το παρασκεύασμα μπορεί να φωτίζεται εκτός από το κλασσικό τρόπο και με υπεριώδη ακτινοβολία. Οι φακοί των μικροσκοπίων αυτών είναι ειδικής κατασκευής, από γυαλί που δεν εμφανίζει "αυτοφθορισμό",  και έχουν χαραγμένη πάνω τους τη λέξη Fluor ή Ultrafluor, μπορούν όμως να χρησιμοποιηθούν και για παρατήρηση σε διάταξη φωτεινού πεδίου.

            Ανάλογα με την τοποθέτηση της πηγής υπεριώδους φωτός τα μικροσκόπια φθορισμού διακρίνονται σε δυο τύπους. α. Το μικροσκόπιο φθορισμού διελεύσεως (transmitted light fluorescence) που είναι και το παλαιότερο, και β. το μικροσκόπιο φθορισμού προσπίπτοντος ακτινοβολίας (epi-fluorescence).

 

            Από τους δυο τύπους, αυτός που έχει επικρατήσει είναι ο δεύτερος για τους πιο κάτω λόγους:

α. Ο αντικειμενικός φακός λειτουργεί και σαν συμπυκνωτής με αποτέλεσμα να μην χρειάζεται ρύθμιση.  Η πορεία των φωτεινών ακτίνων σε αυτόν τον τύπο μικροσκοπίου φαίνονται στην Εικόνα 7..

β. Στο μικροσκόπιο φθορισμού διελεύσεως ο φθορισμός παράγεται στα χαμηλότερα τμήματα του παρασκευάσματος με αποτέλεσμα κατά τη διέλευση της ακτινοβολίας μέσα από το παρασκεύασμα αυτή να διαχέεται.  Έτσι με αυτό το μικροσκόπιο μπορούμε να παρατηρήσουμε παρασκευάσματα με μικρό μόνο σχετικά πάχος.  Αντίθετα στο μικροσκόπιο προσπίπτοντος ακτινοβολίας επειδή και ο φωτισμός και η παρατήρηση γίνονται από την ίδια πλευρά του παρασκευάσματος  η εικόνα από φθορισμό είναι πολύ πιο φωτεινή, με λιγότερο θόρυβο και κατά συνέπεια καλύτερης ποιότητας.

γ. Στο μικροσκόπιο φθορισμού προσπίπτουσας ακτινοβολίας, η προσπίπτουσα ακτινοβολία και η ακτινοβολία από φθορισμό δεν συγχέονται.  Η πρώτη οδεύει μέσα από το παρασκεύασμα προς τα κάτω και χάνεται, με αποτέλεσμα να μην επηρεάζει την εικόνα από φθορισμό.

            Το συνεστιακό μικροσκόπιο μπορεί να θεωρηθεί μια εξελιγμένη μορφή μικροσκοπίου φθορισμού όταν χρησιμοποιείται με τον κατάλληλο τρόπο.

            Μερικά από τα πλεονεκτήματα της παρατήρησης ή διάγνωσης με μικροσκόπιο φθορισμού είναι:

1.  Ευαισθησία.  Απαιτείται πολύ μικρή συγκέντρωση του φθοριοχρώματος (διαλύσεις 1/10.000 -1/100.000) με αποτέλεσμα τη προστασία του παρασκευάσματος από τεχνητές αλλοιώσεις (artefacts), κάτι ιδιαίτερα σημαντικό σε ανοσοβιολογικές τεχνικές όπου οι διάφορες χημικές ουσίες μπορεί να επηρεάσουν την αντιγονικότητα του αντιορού.

2.  Εξειδίκευση.  Οι σύγχρονες μέθοδοι προετοιμασίας παρασκευασμάτων, τα νέα φθοριοχρώματα και τα φίλτρα δίνουν ένα μεγάλο βαθμό εξειδίκευσης με αποτέλεσμα η τεχνική να είναι πολύ αξιόπιστη.

3.  Ταχύτητα και ευκολία.  Τα παρασκευάσματα μπορούν να παρατηρηθούν χωρίς σχεδόν καμία προετοιμασία.

4.  Οι ίδιες τεχνικές μπορούν να εφαρμοστούν σε όλους τους κλάδους της βιοϊατρικής όπως είναι η ιολογία, μυκητολογία, κυτταρολογία, ανοσοβιολογία, παρασιτολογία κλπ.

Αξιοπιστία  Η μέθοδος είναι πολύ αξιόπιστη λόγω της ευαισθησίας και της εξειδίκευσης των φθοριοχρωμάτων με αποτέλεσμα την ελάττωση των λανθασμένων διαγνώσεων ακόμα και από προσωπικό που δεν έχει μεγάλη εμπειρία.

 

Η βιβλιογραφία που σχετίζεται με τη μικροσκοπία φθορισμού είναι τεράστια για να αναφερθεί εδώ.  Πριν εφαρμοστεί οποιαδήποτε τεχνική μικροσκοπίας φθορισμού απαιτείται η σχολαστική μελέτη των οδηγιών χρήσεως του συγκεκριμένου μικροσκοπίου που θα χρησιμοποιηθεί, καθώς επίσης και τους συνδυασμούς φθοριοχρωμάτων, φίλτρων και φακών.    

 

 

1.7     Συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με ακτίνες Laser. (Confocal Laser Scanning Microscope).

            Η συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης αν και βρίσκεται σε πολύ γρήγορη εξέλιξη τα τελευταία χρόνια, η αρχή της λειτουργίας της πρωτοπεριγράφτηκε από τον Minski το 1961.  Αντίθετα με το κλασσικό τρόπο φωτισμού και παρατήρησης που γίνεται στο κοινό μικροσκόπιο, η συνεστιακή μικροσκοπία στηρίζεται στο γεγονός ότι και ο φωτισμός και η παρατήρηση είναι περιορισμένα σε ένα σημείο του παρασκευάσματος.  Αυτό επιτυγχάνεται με τη τοποθέτηση ενός πολύ μικρού διαφράγματος, που μπορεί να είναι μικρότερο από 10 μm, στους οπτικούς άξονες του αντικειμενικού και του συγκεντρωτή φακού.  Η εικόνα σχηματίζεται με σάρωση όλων των σημείων του πεδίου του μικροσκοπίου.  Αρχικά το παρασκεύασμα παρατηρείται με φως ορατού μήκους κύματος ή με υπεριώδες και στη συνέχεια επιλέγεται η ακτίνα Laser αργού (με πιο χρήσιμα peaks στα 488 και 514 nm που συμπίπτουν με το μήκος κύματος που διεγείρει στο μέγιστο τη φλουορεσκίνη και τη ροδαμίνη) ή ηλίου-νέου (με peak  στα 633 nm για άλλα φθοριοχρώματα) ή και με τα δυο συγχρόνως.  Οι εικόνες δεν είναι άμεσα ορατές (real time), αλλά η παρατήρηση γίνεται στην οθόνη του μικροϋπολογιστή του μικροσκοπίου και φυσικά μπορούν να ψηφιοποιηθούν για αποθήκευση ή εκτύπωση (Εικόνα 8). 

            Το σημαντικότερο πλεονεκτήματα του συνεστιακού μικροσκοπίου είναι ότι σε αυτό ελαττώνονται κατά πολύ τα μηνύματα από τα μη εστιασμένα σημεία του παρασκευάσματος με αποτέλεσμα να ενισχύεται η αντίθεση (contrast) του παρασκευάσματος.  Αυτό το χαρακτηριστικό επιτρέπει τη σάρωση του παρασκευάσματος όχι μόνο ως προς τους άξονες x και y αλλά και ως προς τον z  (βάθος) με αποτέλεσμα να παίρνουμε καλά εστιασμένες τρισδιάστατες εικόνες που όμως δεν παρατηρούνται άμεσα, αλλά μέσω μικροϋπολογιστή με ειδικά προγράμματα (software) που κάνουν ψηφιοποίηση και ανακατασκευή της εικόνας. 

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει αυτού του τύπου η μικροσκοπία σε συνδυασμό με το φθορισμό.  Είναι γνωστό ότι είναι αδύνατον να παρατηρηθούν φθορίζοντα παρασκευάσματα πάχους μεγαλύτερου των 10 μm λόγω του δυνατού θορύβου από τα μη εστιασμένα σημεία του παρασκευάσματος. τρισδιάστατες καλά εστιασμένες εικόνες που συγκρίνονται με εκείνες του ΗΜΣ αλλά που να μας δείχνουν συγχρόνως και τη κατανομή των φθοριοχρωμάτων.  Λόγω των πολλών εφαρμογών σχεδόν σε όλους τους τομείς, όλοι οι μεγάλοι κατασκευαστές μικροσκοπίων έχουν ήδη κατασκευάσει τέτοια μικροσκόπια τα οποία και βελτιώνονται συνεχώς

            Εδώ πρέπει να σημειωθεί ότι η βασική σχεδίαση ενός οπτικού μικροσκοπίου είναι η ίδια για όλα τα οπτικά μικροσκόπια που περιγράφτηκαν. Έτσι είναι δυνατόν σε ένα όργανο να υπάρχουν όλοι οι τύποι μικροσκοπίας που αναφέρονται πιο πάνω.  Η μετατροπή από τον ένα τύπο στον άλλο είναι συνήθως πολύ εύκολη και γίνεται με την αντικατάσταση ορισμένων φακών.

 

 

 

1.8     Ανεστραμμένα μικροσκόπια (διαφόρων τύπων, inverted).

            Εκτός από τη κλασσική διάταξη, με το φωτισμό από το κάτω μέρος της τράπεζας και την παρατήρηση να γίνεται από πάνω, υπάρχουν και μικροσκόπια σχεδόν όλων των τύπων με την αντίθετη διάταξη δηλαδή το παρασκεύασμα να φωτίζεται από επάνω και να παρατηρείται από κάτω.  Αυτή η διάταξη διευκολύνει πολλές φορές τη παρατήρηση κυττάρων μέσα σε καλλιέργειες (μέσα σε τρυβλία Petri, φιάλες καλλιέργειας κλπ.).

 

 1.9       Μικροσκόπια αντίκες.

            Σε όλα σχεδόν τα εργαστήρια θα βρούμε και κάποια μικροσκόπια που θα μπορούσαμε να τα χαρακτηρίσουμε αντίκες.  Τα περισσότερα από αυτά είναι πραγματικά τεχνολογικά επιτεύγματα για την εποχή τους και εφ’ όσον έχουν συντηρηθεί και ρυθμιστεί σωστά μπορούν να μας δώσουν εικόνες εφάμιλλες μ’ εκείνες των συγχρόνων μικροσκοπίων.  Τα μικροσκόπια όμως αυτά για να ρυθμιστούν σωστά πρέπει να γνωρίζουμε ορισμένα χαρακτηριστικά τους.  Τα παλιά μικροσκόπια δεν έχουν ενσωματωμένο φωτιστικό σύστημα παρά ένα κάτοπτρο στη βάση του μικροσκοπίου.  Το κάτοπτρο αυτό έχει δυο πλευρές μια επίπεδη και μια κοίλη.  Η επίπεδη πλευρά είναι αυτή που χρησιμοποιείται συνήθως είτε με τεχνητό είτε με φυσικό φωτισμό.  Όταν χρησιμοποιείται φυσικός φωτισμός, το κάτοπτρο πρέπει να στρέφεται προς ένα φωτεινό σημείο του ουρανού ή φωτεινό σύννεφο, όχι όμως απ’ ευθείας στον ήλιο.  Το κοίλο κάτοπτρο χρησιμοποιείται σπάνια και όταν γίνεται παρατήρηση μόνο σε χαμηλή μεγέθυνση και χωρίς τον συμπυκνωτή φακό.  Οι προσοφθάλμιοι φακοί στα παλιά μικροσκόπια είναι συνήθως οι τύπου Huyghens ενώ στα πιο καινούργια χαρακτηρίζονται σαν αντισταθμιστικοί (compensating) και είχαν παλιότερα χαραγμένο το γράμμα Κ ή C δίπλα στον αριθμό που υποδηλώνει τη μεγέθυνση του φακού.  Έτσι ενώ στους σύγχρονους προσοφθάλμιους φακούς για να γίνει σωστά η παρατήρηση το μάτι μας πρέπει να βρίσκεται σε μια απόσταση περίπου 2 cm από το φακό (αλλιώς βλέπουμε μέσα τις βλεφαρίδες μας), στα παλιότερα μικροσκόπια το μάτι μας πρέπει να είναι σχεδόν σε επαφή με τον προσοφθάλμιο φακό.

Οι αντικειμενικοί φακοί στα παλιά μικροσκόπια δεν κάνουν διόρθωση χρωματικών σφαλμάτων και δεν είναι επίπεδοι.  Επίσης δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιοσδήποτε συνδυασμός προσοφθάλμιου με αντικειμενικό φακό, αλλά οι φακοί πάνε σε ζευγάρια π.χ. προσοφθάλμιος Χ7 με αντικειμενικό Χ10, ή Χ10 με Χ40 και Χ15 με Χ90.

 

1.10     Στερεοσκόπιο (οπτικό).

Εικόνα 9. Ένα σύγχρονο οπτικό στερεοσκόπιο.

Το όργανο αυτό βρίσκει εφαρμογές εκεί που χρειαζόμαστε να παρατηρήσουμε σε μεγέθυνση την εξωτερική μορφολογία ενός αντικείμενου,  ιστού κλπ όταν χρησιμοποιείται προσπίπτων ή πλάγιος φωτισμός οργανισμού, ή και την εσωτερική μορφολογία διαφανών ή διαφανοποιημένων παρασκευασμάτων όταν αυτά φωτίζονται από κάτω.  Με αυτό το όργανο πετυχαίνουμε στερεοσκοπική τμήμα του δείγματος από διαφορετική γωνία.  Τα στερεοσκόπια είτε έχουν αντικειμενικούς φακούς σταθερής εστιακής απόστασης (μεγέθυνσης) είτε μεταβαλλόμενης (zoom).  Συνήθως τα όργανα αυτά μπορούν να μεγεθύνουν μέχρι περίπου 80Χ γιατί μεγαλύτερες μεγεθύνσεις έχουν πολύ μικρό βάθος εστίασης και επομένως οι εικόνες δε μπορούν πλέον να θεωρηθούν στερεοσκοπικές.  Το παρασκεύασμα συνήθως δε χρειάζεται καμία προετοιμασία και μπορεί να παρατηρηθεί αρκεί να μπορεί να τοποθετηθεί στο οπτικό πεδίο του μικροσκοπίου.

Στα στερεοσκόπια ο φωτισμός του παρασκευάσματος μπορεί να γίνει και από πάνω και από κάτω.  Τα πιο σύγχρονα στερεοσκόπια διαθέτουν και σύστημα φωτισμού με υπεριώδη ακτινοβολία για μετατροπή τους σε μικροσκόπια φθορισμού.

            Τα στερεοσκόπια έχουν πολλές εφαρμογές στη γεωπονία όπως είναι η μελέτη και προσδιορισμό εντόμων, μικρών καρπών, ασθενειών σε φυτά, πλαγκτονικών οργανισμών κλπ.

            Για καλύτερη παρατήρηση συνιστάται η χρήση ισχυρής φωτεινής πηγής με λαμπτήρα αλογόνου και οπτικές ίνες.

1.11       Βιντεομικροσκόπιο. (Ηλεκτρονικό Στερεοσκόπιο).

            Τα όργανα αυτά είναι σχετικά νέα στην αγορά και ακόμα όχι πολύ διαδεδομένα.  Έχουν εξελιχτεί από τα διάφορα ενδοσκόπια που χρησιμοποιούνται εδώ και αρκετά χρόνια στην Ιατρική, είτε για διαγνωστικούς σκοπούς είτε για τη πραγματοποίηση εγχειρήσεων.  Η λειτουργία τους στηρίζεται στη τεχνολογία των οπτικών ινών και των video cameras υψηλής ανάλυσης που δουλεύουν και με πολύ χαμηλό φωτισμό.  Τα πλεονεκτήματά τους είναι πολλά σε σύγκριση με το κλασσικό οπτικό στερεοσκόπιο.  Μερικά από αυτά είναι:  η μεγέθυνση που μπορεί να είναι συνεχής, και κυμαίνεται από 1Χ - 1000Χ, το βάθος εστίασης που είναι τουλάχιστο δέκα φορές μεγαλύτερο εκείνου του οπτικού στερεοσκοπίου, λειτουργούν με χαμηλό φωτισμό, η κεφαλή του οργάνου μπορεί να μετακινηθεί προς όλες τις κατευθύνσεις.  Οι εικόνες στη συνέχεια μπορούν βέβαια  να αποθηκευθούν σε μαγνητικό δίσκο ηλεκτρονικού υπολογιστή για περαιτέρω επεξεργασία και ανάλυση εικόνας.

            Λόγω της αρκετά μεγάλης μεγέθυνσης, αλλά και καλής διακριτικής ικανότητας που έχουν αυτά τα όργανα πολλές φορές μπορούν να υποκαταστήσουν το ΗΜΣ δεδομένου ότι αυτό σπάνια χρησιμοποιείται για τη παρατήρηση βιολογικών παρασκευασμάτων σε μεγεθύνσεις μεγαλύτερες της τάξης 1000Χ.

1.12     Συντήρηση οπτικών μικροσκοπίων.

            Ακολουθείστε πιστά τις οδηγίες του κατασκευαστή.

 

            Όσο ακριβό και αν είναι ένα μικροσκόπιο η απόδοσή του θα είναι πολύ κακή αν δεν συντηρηθεί σωστά.  Τα μηχανικά μέρη των σημερινών οπτικών μικροσκοπίων έχουν μόνιμη λίπανση και πολύ πιθανό να μη χρειαστούν ποτέ να συντηρηθούν.  Τα οπτικά μέρη είναι συνήθως αυτά που δημιουργούν προβλήματα.   Μερικοί απλοί κανόνες που πρέπει να τηρούνται είναι οι πιο κάτω:

1.  Το μικροσκόπιο πρέπει πάντα να σκεπάζεται όταν δεν χρησιμοποιείται.

2. Το μικροσκόπιο θα πρέπει πάντα να τοποθετείται σε στερεό πάγκο εργασίας, σε χώρο που δεν υπάρχει πολύ σκόνη ενώ ο χώρος θα πρέπει να μπορεί να συσκοτίζεται για ορισμένες χρήσεις του μικροσκοπίου.

3.  Οι φακοί του μικροσκοπίου πρέπει να καθαρίζονται τακτικά με ειδικό χαρτί καθαρισμού φακών (π.χ. Watmann Lens Tissue).

Εναλλακτικά για τον καθαρισμό των φακών μπορεί να χρησιμοποιηθεί καλής ποιότητας χαρτομάντιλο.  Σε περίπτωση που ο φακός δεν καθαρίζει με σκέτο χαρτί χρησιμοποιήστε τα χνώτα σας (μια εύκολη πηγή αποσταγμένου νερού) και απαλό τρίψιμο.  Σε εξαιρετικές περιπτώσεις, όταν ο φακός είναι πολύ λερωμένος, όπως στην περίπτωση που ο καταδυτικός φακός έχει μείνει πολύ καιρό με το λάδι και αυτό έχει στερεοποιηθεί (αυτό συνέβαινε με τα παλιά λάδια κατάδυσης, όπως ήταν το φυσικό κεδρέλαιο, τα σημερινά λάδια δεν πήζουν), καθαρίστε τον προσεκτικά με οργανικό διαλύτη που εξατμίζεται γρήγορα όπως ένα μίγμα που αποτελείται από 70% αιθέρα και 30% αιθανόλη ή εναλλακτικά με ξυλόλη.  Στη περίπτωση που χρησιμοποιηθεί ξυλόλη το καθάρισμα πρέπει να είναι πολύ σύντομο αλλιώς υπάρχει κίνδυνος να διαλυθεί η κόλλα που συγκρατεί το φακό στη θέση του αλλά και να καταστραφεί η μοβ επίστρωση  του φακού που είναι για τη διόρθωση χρωματικών σφαλμάτων.  Με τα καινούργια λάδια κατάδυσης συνιστάται να μή καθαρίζεται ο φακός μετά από κάθε χρήση.

3.  Μην  ανοίγετε ποτέ τους φακούς.  Είναι σχεδόν αδύνατον ένας φακός να έχει λερωθεί μέσα.  Αυτό ισχύει κυρίως για τους αντικειμενικούς φακούς που αποτελούνται από μια σειρά φακών που είναι τοποθετημένοι σε μια σειρά που δεν είναι καθόλου τυχαία!

4.  Αν το μικροσκόπιο έχει ποτενσιόμετρο για τη ρύθμιση της έντασης του φωτισμού, όταν απλά κάνετε μια παρατήρηση, μην έχετε την ένταση στο μέγιστο.  Έτσι παρατείνεται κατά πολύ η ζωή της λάμπας, σε πολλά μικροσκόπια οι λάμπες είναι πολύ ακριβές και δυσεύρετες.  Η λάμπα όμως πρέπει να είναι στο μέγιστο (ή σε κάποια σχετική ένδειξη χαραγμένη στο ποτενσιόμετρο) όταν πρόκειται να γίνει φωτογράφηση με έγχρωμο film.   To έγχρωμο film πρέπει να έχει την ένδειξη «τεχνητού φωτισμού» (Tungsten) για να έχουμε καλή απόδοση των χρωμάτων.  Έχετε πάντα μια ανταλλακτική λάμπα πρόχειρη.  Με τις ψηφιακές φωτογραφικές μηχανές χρησιμοποείτε το white balance πριν τη φωτογράφιση σε μια περιοχή του παρασκευάσματος χωρίς δείγμα

5.  Χρειάζεται ιδιαίτερη προσοχή όταν το παρασκεύασμα περιέχει καυστικές ή όξινες ουσίες (π.χ. χρώση φλωρογλυκίνης με HCl) που μπορούν πολύ γρήγορα να διαβρώσουν τα μεταλλικά μέρη του μικροσκοπίου αλλά και να καταστρέψουν τις διορθωτικές επιστρώσεις των φακών.

6.  Αν στο Εργαστήριο υπάρχουν παλιά λάδια κατάδυσης αυτά δεν πρέπει να χρησιμοποιηθούν γιατί αν μεν πρόκειται για φυσικό Κεδρέλαιο αυτό πήζει και είναι δύσκολο να καθαριστούν οι φακοί, ενώ κάποια άλλα λάδια έχουν χαρακτηριστεί σαν ισχυρά καρκινογόνα.  Αν υπάρχει αμφιβολία, προμηθευτείτε νέο λάδι κατάδυσης.  Ειδικά για μικροσκοπία φθορισμού με καταδυτικό φακό θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί ειδικό λάδι κατάδυσης που δεν εμφανίζει "αυτοφθορισμό".