Συνταγές των πιο συνηθισμένων διαλυμάτων που χησιμοπιούνται στην ηλεκτρονική μικροσκοπία.

Προσοχή:  Τα περισσότερα από τα χημικά που χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο μικροσκοπίας είναι λίγο ως πολύ επικίνδυνα.  Διαβάζετε πάντα τις ετικέτες που βρίσκονται στις συσκευασίες των χημικών ή ρωτήστε κάποιον που γνωρίζει.

Απαγορεύεται αυστηρά η κατανάλωση τροφίμων ή το κάπνισμα στους πάγκους όπου εκτελούνται πειράματα. Πριν φύγουμε από τους χώρους του Εργαστηρίου  επιβάλλεται καλό πλύσιμο των χεριών με σαπούνι και άφθονο νερό.  

1.1     Ρυθμιστικά διαλύματα.

 i. Φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα 0.1Μ (Sörensen).

    Διάλυμα stock Α: Na₂HPO₄*2H₂O      17.80 g/l

    Διάλυμα stock Β: NaH₂PO₄*H₂O        13.80 g/l

            Τα διαλύματα Α και Β μπορούν να  διατηρηθούν στο ψυγείο για μερικές εβδομάδες.  Πριν από τη χρήση για να φτιάξουμε ρυθμιστικό διάλυμα με pH=7.2 ανακατεύουμε 36.0 ml από το Α και 14.0 ml από το Β.

ii. Ρυθμιστικό διάλυμα κακοδυλικού νατρίου (sodium cacodylate) (0.1Μ).

C₂H₆AsO₂Na • 3H₂O

 Προσοχή: το κακοδυλικό νάτριο είναι ισχυρό δηλητήριο γιατί περιέχει αρσενικό (As).

2.15 g κακοδυλικό νάτριο (sodium cacodylate) σε 100 ml αποστ. νερό.  Το pH ρυθμίζεται στο 7.2-7.4 με Ν.HCl.  Το έτοιμο διάλυμα διατηρείται στο ψυγείο στους 4 ^οC για μερικές μέρες.

iii. Ρυθμιστικό διάλυμα PIPES (0.2M). 

PIPES - Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)

6 g PIPES σε 50 ml αποσταγμένο νερό.  Προτίθεται Ν.NaΟΗ σταγόνα-σταγόνα μέχρι το διάλυμα να γίνει διαυγές.  Το pH ρυθμίζεται στο 7.2-7.4 και συμπληρώνεται το διάλυμα μέχρι τα 100 ml.  Διατηρείται στους 4 ^οC για μερικές μέρες.

1.2       Mονιμοποιητικά (στερεωτικά) διαλύματα.

Προσοχή: η γλουταρική αλδεΰδη θα πρέπει να είναι 25% ειδικά αποσταγμένη για ηλεκτρονική μικροσκοπία και να μην περιέχει σταθεροποιητή (amberlyst).

 Μονιμοποιητικά (στερεωτικά) διαλύματα.

i. Γλουταρική αλδεΰδη (glutaraldehyde) 3%   

OCH(CH₂)₃CHO

            ρυθμιστικό διάλυμα                       88 ml

            γλουταρική αλδεΰδη 25%             12 ml

ii. Γλουταρική αλδεΰδη (glutaraldehyde) 5%

            ρυθμιστικό διάλυμα                      10 ml

            γλουταρική αλδεΰδη 25%             5 ml

το pH ρυθμίζεται με N.NaOH στο 7.2-7.4 και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τα 25 ml με Η₂Ο. 

iii. Γλουταρική αλδεΰδη / παραφορμαλδεΰδη (Karnovsky). 
 

OCH(CH₂)₃CHO  /  (CH2O) n

 2 g παραφορμαλδεΰδης διαλύονται σε 25 ml αποστ. νερό στους 60-70 ^οC με ανάδευση.  Προστίθεται 1Ν NaOH σταγόνα-σταγόνα με συνεχή ανάδευση μέχρι το διάλυμα να γίνει διαυγές.  Όταν κρυώσει το διάλυμα προστίθενται 10 ml γλουταρικής αλδεΰδης 25% και συμπληρώνεται το διάλυμα μέχρι τα 50 ml με φωσφορικό ή κακοδυλικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 7.2 - 7.6.  Το τελικό pH είναι 7.2.= ή ανάδευση μέχρι το διάλυμα να γίνει διαυγές.  Αφού κρυώσει το διάλυμα προστίθενται 10 ml γλουταρικής αλδεϋδης 25% και συμπληρώνεται το διάλυμα μέχρι τα 50 ml με φωσφορικό ή κακοδυλικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 7.2-7.6.  Το τελικό pH είναι 7.2.

(Η γλουταρική αλδεΰδη μπορεί να χρησιμοποιηθεί με οποιοδήποτε από τα πιο πάνω ρυθμιστικά διαλύματα).

iv. Tετροξείδιο του Οσμίου (OsO₄₎ 1%.

Ποσοχή: το OsO₄ είναι ισχυρό δηλητήριο, πρέπει πάντα να χρησιμοποιείται σε απαγωγό ενώ οι αμπούλες πρέπει να σπάζονται από κάποιον ειδικά εκπαιδευμένο.

Το OsO₄ υπάρχει συνήθως σε κρυσταλλική μορφή μέσα σε γυάλινες αμπούλες του 0.1 g, 0.5 g και 1.0 g ή σε αμπούλες με έτοιμο διάλυμα  1% ή 2%.  Η αμπούλα καθαρίζεται προσεκτικά από την ετικέτα και τα υπολείμματα κόλλας με ακετόνη, αν δεν είναι προχαραγμένη, χαράζεται με το ειδικό μαχαιράκι, ή καλής ποιότητας λεπτή λίμα και τοποθετείται σε καλά σφραγισμένο μπουκάλι με 10 ml (100 ml για τη συσκευασία του 1.0 g) αποσταγμένο νερό, ή φωσφορικό ή κακοδυλικό ρυθμιστικό διάλυμα (όχι PIPES) και το μπουκάλι ανακινείται βίαια μέχρι να σπάσει η αμπούλα.  Το OsO₄ διαλύεται αργά (περίπου 24 h).  Η διάλυσή του διευκολύνεται αν τοποθετηθεί σε συσκευή υπερήχων.   = ι PIPES)  και το μπουκάλι ανακινείται βίαια μέχρι να σπάσει η αμπούλα.  Το OsO4 διαλύεται αργά (περίπου 24 h).  Η διάλυσή του διευκολύνεται άν τοποθετηθεί σε συσκευή υπερήχων.   

v. Οξικό ουρανύλιο (uranyl acetate) 5%.

UO₂(CH₃COO)₂·2H₂O  

Προσοχή: το οξικό ουρανύλιο είναι πολύ τοξικό διότι περιέχει απεμπλουτισμένο ουράνιο (αυτό περιείχαν και οι βόμβες με τις οποίες βομβάρδισαν οι Αμερικάνοι τη Σερβία) το οποίο είναι ασθενές ραδιενεργό στοιχείο με πολύ μεγάλο χρόνο ημιζωής (περίπου 2500 χρόνια).

5 g οξικό ουρανύλιο διαλύονται σε 100 ml αποσταγμένο νερό (χρειάζεται περίπου 48 h), το διάλυμα είναι κορεσμένο.

1.3      Eποξικές ρητίνες.

ΠΡΟΣΟΧΗ:  Όλες οι εποξικές ρητίνες είναι μεταλλαξογόνες και ελαφρά (;) καρκινογόνες.  Πρέπει να αποφεύγεται η επαφή με το δέρμα.  Σε περίπτωση επαφής με το δέρμα δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί οργανικός διαλύτης  αλλά ζεστό νερό σαπούνι και βουρτσάκι ή ειδική αλοιφή καθαρισμού για ρητίνες και χρώματα (πωλούνται στα είδη συνεργείων αυτοκινήτων, π.χ. Swarfega).

Το περίσσευμα της ρητίνης και τα διάφορα αναλώσιμα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν, αλουμινόχαρτο κλπ πρέπει να τοποθετούνται σε μεταλλικά κουτά (από καφέ κλπ) και να πολυμερίζονται στον κλίβανο πριν να πεταχτούν στα σκουπίδια.

Σε όλες τις ρητίνες τα συστατικά προσθέτονται ένα-ένα και ανακατεύονται καλά πριν να προστεθεί το επόμενο.  Το τελικό μίγμα ανακατεύεται για μερικές ώρες στο μαγνητικό αναδευτήρα πριν να χρησιμοποιηθεί.  Το μίγμα μπορεί να διατηρηθεί για πολλές εβδομάδες ή και μήνες στη κατάψυξη αφού όμως το δοχείο σφραγιστεί αεροστεγώς.  Πριν ανοιχτεί το δοχείο πρέπει να έρθει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για να μη δημιουργηθεί συμπύκνωση υδρατμών.

Προσοχή: οι ρητίνες είναι υγροσκοπικές και πρέπει να διατηρούνται πάντα σε σφραγισμένα δοχεία σε ξερό περιβάλλον.  Ρητίνη με υγρασία είναι αδύνατον να κοπεί στον υπερμικροτόμο.

            Πιο κάτω δίνονται μερικές μόνο συνταγές εποξικών ρητινών από τις μερικές δεκάδες που υπάρχουν και είναι αυτές που χρησιμοποιούνται περισσότερο από το συγγραφέα και δίνουν ικανοποιητικά αποτελέσματα στα περισσότερα είδη βιολογικών παρασκευασμάτων.

i.         

Το EPON 812 εδώ και πολλά χρόνια έχει απαγορευτεί ως ισχυρό καρκινογόνο, διατίθενται όμως υποκατάστατα με τα ίδια αποτελέσματα.

ii.        

            Aυτή η ρητίνη, λόγω του πολύ χαμηλού ιξώδους της συνιστάται για σκληρά και δύσκολα παρασκευάσματα όπως είναι πολλά φυτικά.

iii

            Τα συστατικά ανακατεύονται καλά. Το μίγμα μπορεί να διατηρηθεί χωρίς τον πολυμεριστή (BDMA) σε σκοτεινό μπουκάλι για περισσότερο από ένα χρόνο.  Για να το χρησιμοποιήσουμε μετράμε τη ποσότητα που θέλουμε (σε όγκο) και προσθέτουμε 1% BDMA.

1.4       Χρωστικές. 

i.  Οξικό ουρανύλιο (για χώση τομών και χρώση en block).

Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορα διαλύματα από 2% μέχρι κορεσμένο και με διαλύτη νερό, μεθανόλη 50% ή αιθανόλη 50%-70%.  Στο εργαστήριό μας συνήθως χρησιμοποιούμε διάλυμα 2% σε νερό.  Το μπουκάλι με τη χρωστική φυλάγεται στο ψυγείο στο σκοτάδι.

ΠΡΟΣΟΧΗ: Το οξικό ουρανύλιο πρέπει να φυλάγεται μακριά από το χώρο δουλειάς και μακριά από φωτοευαίσθητα υλικά γιατί είναι ραδιενεργό ενώ απαγορεύεται αυστηρά η κατανάλωση τροφών, ποτών και το κάπνισμα κατά τη χρήση αυτής της ουσίας.

ii.  Κιτρικός μόλυβδος (Lead citrate.  Reynolds)

C12 H10 O14 Pb3 . 3H2O

            Ανακατεύουμε 1.33 g νιτρικό μόλυβδο (lead nitrate) με 1.76 g κιτρικό νάτριο (sodium nitrate), (οι ποσότητες πρέπει να είναι ζυγισμένες με ακρίβεια γιατί οι δυο ενώσεις αντιδρούν μεταηύ τους και η αντίδραση είναι στοιχειομετρική) και 30 ml αποστ. νερό σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml.  Ανακινούμε δυνατά συνέχεια για 1 min και μετά πάλι κάθε 5 min για μισή ώρα.     Προσθέτουμε 8.0 ml Ν.NaOH (οπότε το διάλυμα γίνεται διαυγές) και συμπληρώνουμε μέχρι τα 50 ml με αποστ. νερό.  Ανακατεύομε με αναστροφή (όχι ανακίνηση).  Η χρωστική αυτή αντιδρά με το CO₂, γι’ αυτό το μπουκαλάκι πρέπει να φυλάγεται μέσα σε δοχείο που περιέχει στερεό NaOH.

iii. Κιτρικός μόλυβδος (Fahmy).

C12 H10 O14 Pb3 . 3H2O

 0.1-0.2 g NaOH διαλύονται σε 50 ml φρεσκοαποσταγμένο νερό στο οποίο στη συνέχεια διαλύεται 0.25 g κιτρικός μόλυβδος.

iv.  Υπερμαγγανικό κάλιο (potassium permanganate).

KMnO₄ 

2% Υπερμαγγανικό κάλιο σε αποσταγμένο νερό.  Το διάλυμα πρέπει να φτιάχνεται λίγο πριν χρησιμοποιηθεί.

v.   Κυανούν της τολουϊδίνης (Τoluidine Blue).

1% Κυανούν της τολουϊδίνης σε 1% βόρακα σε αποσταγμένο νερό.  Αν η χρώση είναι πολύ έντονη μπορεί η χρωστική να διαλυθεί με 1% βόρακα μέχρι 1:10.  Η χρωστική καλό είναι να διηθείται ή να φυγοκεντρίζεται.

            Η χρωστική αυτή χρησιμοποιείται για την παρατήρηση ημίλεπτων τομών (πάχους 2-4 μm) με το οπτικό μικροσκόπιο από παρασκευάσματα που έχουν προετοιμαστεί για το ΗΜΔ.  Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί σαν γενική χρωστική για βοτανικά παρασκευάσματα.  Σε αυτή τη περίπτωση το κυανό της τολουϊδίνης συμπεριφέρεται ως μεταχρωματική χρωστική.  Έτσι η κυτταρίνη και άλλα κυτταρικά συστατικά χρωματίζονται μπλε ενώ η λιγνίνη ιώδης.

vi.  Φωσφοβολφραμικό οξύ (PTA)  H₃P W₁₂O_40.

            Διάλυμα 1-2% σε αποσταγμένο νερό.  Το pH μπορεί να ρυθμιστεί με HCl ή NaOH στην επιθυμητή τιμή.  Αυτή η χρωστική είναι η πιο κοινή για την αρνητική χρώση ιών φυτών και ζώων ή βακτηρίων.