Εντοπισμός εκκινητών (primers) για χρήση στην μέθοδο του PCR

Εισαγωγή.

Ακολουθίες DNA από μιτοχονδριακά γονίδια χρησιμοποιούνται όλο και συχνότερα για τον υπολογισμό φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των ειδών του ζωικού βασιλείου. Η γνώση των εξελικτικών διεργασιών μπορεί να χρησιμοποιηθή για την βελτιστοποίηση τύπων σχέσεων μεταξύ ειδών και να βοηθήση στην εκτίμηση της φυλογενετικής χρησιμότητας γονιδίων και νουκλεοτιδίων.

Η εισαγωγή της μεθόδου του PCR (polymerase chain reaction) προκάλεσε επανάσταση στην μοριακή βιολογία και συνδυασμό των μοριακών, εξελικτικών και συστηματικών αντιμετωπίσεων. Το PCR , μέσα από την παραγωγή καθαρού γενετικού υλικού, επιταχύνει τον προσδιορισμό της ακολουθίας του DNA και διευκολύνει την επιλογή καθωρισμένων γονιδιακών περιοχών. Η χρήση εκκινητών (Primers) διευρυμένων για πολλά είδη (universal) επιτρέπει τον προσδιορισμό ακολουθιών για είδη που δεν υπάρχει προηγούμενη πληροφόρηση για τις νουκλεοτιδικές ακολουθίες.

Η φιλοσοφία αυτής της άσκησης είναι:

1. Ο εντοπισμός εκκινητών και primer pairs για μία σειρά ακολουθιών μιτοχονδιακού DNA και πιό συγκεκριμένα για την περιοχή που εκφράζει την μονάδα 16S του μιτοχονδρίου.

2. Η δοκιμή των προτεινόμενων εκκινητών και άλλων που δίνονται σε μία διευρυμένη σειρά μιτοχονδιακών DNA και υπολογισμός της ενέργειας σύνδεσης και ομολογίας με την κάθε ακολουθία ξεχωριστά.

3. Ο εντοπισμός των εκκινητών σε δύο ακολουθίες. Αυτές της πάπιας και του ανθρώπου.

Μερικά στοιχεία για τον καθωρισμό των εκκινητών.

Είναι πολύ σημαντικό ο προσδιορισμός εκκινητών που είναι πολύ εξειδικευμένοι για μία ή περισσότερς νουκλεοτιδικές ακολουθίες. Οι επιλεγμένοι εκκινητές πρέπει να είναι ικανοί να δεσμεύονται καλά σε συγκεκριμένα σημεία της νουκλεοτιδικής ακολουθίας και να επεκτείνονται στην σωστή κατεύθυνση όπως επίσης να έχουν ελάχιστη πιθανότητα να δεσμεύονται κάπου αλλού. Για τον υπολογισμό της ανεκτικότητας της εξιδείκευσης και της πιθανότητας ο εκκινητής να αλληλεπιδρά κατά ένα τυχαίο τρόπο χρησιμοποιείται το ενεργειακό κριτήριο. Βασίζεται στο ότι η πιθανότητα δέσμευσης εξαρτάται από την θερμοδυναμική σταθερότητα της διπλής αλυσίδας που εκφράζεται από την ελεύθερη ενέργεια του συστήματος κατά Gibbs (ΔG). Η τελευταία βέβαια ειναι αποτέλεσμα της δημιουργίας αλληλεπιδράσεων όπως υδρογονικών δεσμών, Van der Waals, σχηματισμό εσωτερικών βρόγχων και χαλαρών άκρων.

Εκτός από την εξειδίκευση οι επιλεγμένοι εκκινητές πρέπει να έχουν ωρισμένες ιδιότητες:

1. Να μην περιέχουν επαναλαμβανόμενες ακολουθίες.

2. να μην περιέχουν μεγάλα ποσοστά GC και μεγάλα ποσοστά επαναλαμβανόμενων βάσεων.

3. Να μην περιέχουν βρόγχους ( η θερμοκρασία διάσπασης του εκκινητή να είναι τουλάχιστον 25 °C υψηλότερη από την θερμοκρασία διάσπασης των πλέον σταθερών βρόγχων.

4. Να μην μπορούν να φτιάξουν διμερή μεταξύ τους.

5. Η θερμοκρασία δίασπασης τους να είναι όπως ορίζεται κατά περίπτωση και μεταξύ των ορίων άνω των 35 °C και κάτω των 73 °C .

Εκτέλεση της άσκησης

ΜΕΡΟΣ 1ον

1.Εκτελείτε το πρόγραμμα PRIMERM και επιλέγεται από το μενού την επιλογή AUTO-SEARCH.

2. Διαβάζεται με την επιλογή SEQUENCES στο πρόγραμμα τις ακολουθίες μιτοχονδριακού DNA με την σειρά που δινόνται παρακάτω:

* Sequence 1 duckmdna.seq *

* Sequence 2 gorimdna.seq *

* Sequence 3 humamdna.seq *

* Sequence 4 seaumdna.seq *

* Sequence 5 xenomdna.seq *

3. Επιλέγεται το UNIVERSAL για να εντοπίσετε primers που είναι κοινοί για όλες τις ακολουθίες και ζεύγη primers επίσης κοινά για όλες τις επιλεγμένες ακολουθίες. Eπιλέξτε το RUN. Ο υπολογισμός παίρνει περίπου 10 λεπτά και οι ακολουθίες συγκρίνονται για ομόλογα νουκλεοτίδια με μήκη από 16-26 βάσεις. Μετά την ολοκλήρωση του υπολογισμού επιλέξτε να δείτε τα αρχεία PRIMERS, PAIRS και LOCATION και εντοπίστε τις θέσεις των primers για τις ακολουθίες των duck & human που δίνονται στο παράρτημα της άσκησης. Τι παρατηρείτε;

ΜΕΡΟΣ 2ον

1.Εκτελείτε το πρόγραμμα PRIMERM και επιλέγεται από το μενού την επιλογή Primer_test.

2. Διαβάζεται με την επιλογή SEQUENCES στο πρόγραμμα τις ακολουθίες μιτοχονδριακού DNA με την σειρά που δινόνται παρακάτω:

***************************************************************************

* Sequence 1 bee_mdna.seq *

* Sequence 2 bphymdna.seq *

* Sequence 3 drosmdna.seq *

* Sequence 4 duckmdna.seq *

* Sequence 5 flexmdna.seq *

* Sequence 6 gorimdna.seq *

* Sequence 7 humamdna.seq *

* Sequence 8 seaumdna.seq *

* Sequence 9 xenomdna.seq *

***************************************************************************

3. Επιλέγετε το Test on Sequences - Best Energy - Number - 9 - και μετά με ESC επανέρχεστε στο αρχικό μενού.

4. Δίνονται οι παρακάτω εκκινητές:

5’ ATGTTTTTGTTAAACAGGCG 3’

5’ CGCCTGTTTAACAAAAACAT 3’

όπως και τα universal primers που βρήκατε από το πρώτο μέρος της άσκησης.

5. Για κάθε εκκινητή που θέλετε να δοκιμάσετε επιλέγετε Primer και πληκτρολογείτε την νουκλεοτιδική ακολουθία του και το πλήκτρο ΕΝΤΕR. Μετά επιλέγετε το Run οπότε το πρόγραμμα δοκιμάζει τον εκκινητή του επιλέξατε στις εννέα ακολουθίες.

6. Εξετάσετε το αρχείο primetest με το πλήκτρο F3 και καταγράψετε τα αποτελέσματα.

7. Επαναλάβατε την διαδικασία 5,6 για τους δύο primers που δίνονται και για τους Universal primers που βρήκατε από το πρώτο μέρος της άσκησης.

8. Αξιολογήστε τα αποτελέσματα σας. Ποιοι είναι οι καλλίτεροι εκκινητές;
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

ΕΥΡΕΣΗ UNIVERSAL PRIMERS ΚΑΙ UNIVERSAL PRIMER PAIRS

***************************************************************************

* Regime UNIVERSAL *

* Sequence 1 duckmdna.seq *

* Sequence 2 gorimdna.seq *

* Sequence 3 humamdna.seq *

* Sequence 4 seaumdna.seq *

* Sequence 5 xenomdna.seq *

* *

* Localization of primers is shown on sequence duckmdna *

* Their localization on other sequences can be seen in the table below *

***************************************************************************

PRIMER PAIRS

1 SIZE OF FRAGMENT 111

( + ) ( - )

5'aaagggtttacgacctcgatgttgga3' 3'ggatgcactagactcaagtctggcct5'

642 667 727 752

ANNEALING T. 67.1(44.4) 64.6(63.1)°C

MAX.ENERGY (ΔG°m) -43.3 -47.9 kcal/mol

DELTA (ΔG°m-ΔG°s) 35.7 43.5 kcal/mol

2 SIZE OF FRAGMENT 124

( + ) ( - )

5'aaagggtttacgacctcgatgttgga3' 3'tcaagtctggcctcattaggtccagc5'

642 667 740 765

ANNEALING T. 67.1(44.4) 65.0(35.8)°C

MAX.ENERGY (ΔG°m) -43.3 -43.7 kcal/mol

DELTA (ΔG°m-ΔG°s) 35.7 37.3 kcal/mol

____________________________________________________________________________I

I I Primer + | Primer + I Primer - | Primer - I

I Sequence ________________________________________________________________I

I I 5' 3' | 5' 3' I 3' 5' | 3' 5' I

============================================================================I

I duckmdna I 122 137 | 642 667 I 123 138 | 646 671 I

____________________________________________________________________________I

I gorimdna I 1886 1901 | 2391 2416 I 1887 1902 | 2395 2420 I

I humamdna I 1891 1906 | 2396 2421 I 1892 1907 | 2400 2425 I

I seaumdna I 5049 5064 | 5574 5599 I 5050 5065 | 5578 5603 I

I xenomdna I 3930 3945 | 4463 4488 I 3931 3946 | 4467 4492 I

============================================================================I

I duckmdna I 719 744 | 725 750 I 727 752 | 733 758 I

____________________________________________________________________________I

I gorimdna I 2467 2492 | 2473 2498 I 2475 2500 | 2481 2506 I

I humamdna I 2472 2497 | 2478 2503 I 2480 2505 | 2486 2511 I

I seaumdna I 5650 5675 | 5656 5681 I 5658 5683 | 5664 5689 I

I xenomdna I 4540 4565 | 4546 4571 I 4548 4573 | 4554 4579 I

============================================================================I

I duckmdna I 751 776 | I 740 765 | I

____________________________________________________________________________I

I gorimdna I 2499 2524 | I 2488 2513 | I

I humamdna I 2504 2529 | I 2493 2518 | I

I seaumdna I 5682 5707 | I 5671 5696 | I

I xenomdna I 4572 4597 | I 4561 4586 | I

============================================================================I

INDIVIDUAL PRIMERS

( + ) ( - )

5'aaaggaactcggcaaa3' 3'ttccttgagccgttta5'

122 137 123 138

ANNEALING T. 55.3(53.3) 55.3(53.6) °C

MAX.ENERGY (ΔG°m) -32.2 -31.7 kcal/mol

DELTA (ΔG°m-ΔG°s) 19.3 20.1 kcal/mol

( + ) ( - )

5'aaagggtttacgacctcgatgttgga3' 3'ccaaatgctggagctacaacctagtc5'

642 667 646 671

ANNEALING T. 67.1(44.4) 64.9(55.2) °C

MAX.ENERGY (ΔG°m) -43.3 -44.7 kcal/mol

DELTA (ΔG°m-ΔG°s) 35.7 40.1 kcal/mol

( + ) ( - )

5'attaaagtcctacgtgatctgagttc3' 3'ggatgcactagactcaagtctggcct5'

719 744 727 752

ANNEALING T. 58.2(48.5) 64.6(63.1) °C

MAX.ENERGY (ΔG°m) -39.7 -47.9 kcal/mol

DELTA (ΔG°m-ΔG°s) 34.1 43.5 kcal/mol

( + ) ( - )

5'gtcctacgtgatctgagttcagaccg3' 3'actagactcaagtctggcctcattag5'

725 750 733 758

ANNEALING T. 63.6(62.8) 60.0(50.7) °C

MAX.ENERGY (ΔG°m) -45.7 -40.9 kcal/mol

DELTA (ΔG°m-ΔG°s) 42.2 36.8 kcal/mol

( + ) ( - )

5'gagtaatccaggtcggtttctatcta3' 3'tcaagtctggcctcattaggtccagc5'

751 776 740 765

ANNEALING T. 59.4(35.3) 65.0(35.8) °C

MAX.ENERGY (ΔG°m) -36.8 -43.7 kcal/mol

DELTA (ΔG°m-ΔG°s) 32.6 37.3 kcal/mol

2. ΕΛΕΓΧΟΣ ΜΕ ΕΝΕΡΓΕΙΑΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ PRIMERS ΣΕ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΑΚΟΛΟΥΘΙΕΣ mDNA

***************************************************************************

* *

* Sequence 1 flexmdna.seq * Flexamia gramminea mitochondrial 16S ribos.RNA (16S rRNA) gene

* Sequence 2 bphymdna.seq * B.physalus mitochondrial DNA, complete genome

* Sequence 3 humamdna.seq * H.sapiens mitochondrial genome (consensus sequence).

* Sequence 4 seaumdna.seq * Sea urchin complete mitochondrial genome.

* Sequence 5 drosmdna.seq * Drosophila melanogaster mitoch. DNA with 12 tRNAs and 7 genes

* Sequence 6 xenomdna.seq * Xenopus laevis mitochondrial DNA, complete genome.

* Sequence 7 bee_mdna.seq * Apis mellifera mitoch.ribosomal RNA large subunit (16S rRNA)

* Sequence 8 duckmdna.seq * A.platyrhynchos (duck) mitoch.DNA for 16S rRNA and tRNA-Leu.

* Sequence 9 gorimdna.seq * Gorilla mitochondrial DNA, comlete sequence.

* *

***************************************************************************

***************************************************************************

PRIMER 5'CGCCTGTTTAACAAAAACAT 3'=>

***************************************************************************

ANNEALING TEMPERATURE IS 55.6 °C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

SEARCH FOR ENERGETICALLY MOST PROFITABLE PRIMING SITES *

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

1 20

| |

(-)flexmdna<=3'gcggacaaattgtttttgta 5'

IIIIIIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -37.2 kcal/mol

primer 5'cgcctgtttaacaaaaacat 3'=>

primer <=3'tacaaaaacaatttgtccgc 5'

IIIIIIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -37.2 kcal/mol

(+)drosmdna 5'atgtttttgttaaacaggcg 3'=>

| |

8106 8125

2369 2388

| |

(-)bphymdna<=3'gcggacaaatggtttttgta 5'

IIIIIIIIII IIIIIIIII ΔG°= -30.8 kcal/mol

primer 5'cgcctgtttaacaaaaacat 3'=>

1915 1934

| |

(-)humamdna<=3'gcggacaaatggtttttgta 5'

IIIIIIIIII IIIIIIIII ΔG°= -30.8 kcal/mol

primer 5'cgcctgtttaacaaaaacat 3'=>

5073 5092

| |

(-)seaumdna<=3'gcggacaaatggtttttgta 5'

IIIIIIIIII IIIIIIIII ΔG°= -30.8 kcal/mol

primer 5'cgcctgtttaacaaaaacat 3'=>

3956 3975

| |

(-)xenomdna<=3'gcggacaaatggtttttgta 5'

IIIIIIIIII IIIIIIIII ΔG°= -30.8 kcal/mol

primer 5'cgcctgtttaacaaaaacat 3'=>

1910 1929

| |

(-)gorimdna<=3'gcggacaaatggtttttgta 5'

IIIIIIIIII IIIIIIIII ΔG°= -30.8 kcal/mol

primer 5'cgcctgtttaacaaaaacat 3'=>

146 165

| |

(-)duckmdna<=3'gctgacaaatggtttttgta 5'

II IIIIIII IIIIIIIII ΔG°= -21.1 kcal/mol

primer 5'cgcctgtttaacaaaaacat 3'=>

3977 cgaat 3997

| / \ |

(-)xenomdna<=3'gcggagaa tttttgta 5'

IIIII II IIIIIIII ΔG°= -13.3 kcal/mol

primer 5'cgcctgtttaac-aaaaacat 3'=>

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

***************************************************************************

PRIMER 5'ATGTTTTTGTTAAACAGGCG 3'=>

***************************************************************************

ANNEALING TEMPERATURE IS 55.6 °C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

SEARCH FOR ENERGETICALLY MOST PROFITABLE PRIMING SITES *

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

primer <=3'gcggacaaattgtttttgta 5'

IIIIIIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -37.2 kcal/mol

(+)flexmdna 5'cgcctgtttaacaaaaacat 3'=>

| |

1 20

8106 8125

| |

(-)drosmdna<=3'tacaaaaacaatttgtccgc 5'

IIIIIIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -37.2 kcal/mol

primer 5'atgtttttgttaaacaggcg 3'=>

primer <=3'gcggacaaattgtttttgta 5'

IIIIIIIIII IIIIIIIII ΔG°= -30.8 kcal/mol

(+)bphymdna 5'cgcctgtttaccaaaaacat 3'=>

| |

2369 2388

primer <=3'gcggacaaattgtttttgta 5'

IIIIIIIIII IIIIIIIII ΔG°= -30.8 kcal/mol

(+)humamdna 5'cgcctgtttaccaaaaacat 3'=>

| |

1915 1934

primer <=3'gcggacaaattgtttttgta 5'

IIIIIIIIII IIIIIIIII ΔG°= -30.8 kcal/mol

(+)seaumdna 5'cgcctgtttaccaaaaacat 3'=>

| |

5073 5092

primer <=3'gcggacaaattgtttttgta 5'

IIIIIIIIII IIIIIIIII ΔG°= -30.8 kcal/mol

(+)xenomdna 5'cgcctgtttaccaaaaacat 3'=>

| |

3956 3975

primer <=3'gcggacaaattgtttttgta 5'

IIIIIIIIII IIIIIIIII ΔG°= -30.8 kcal/mol

(+)gorimdna 5'cgcctgtttaccaaaaacat 3'=>

| |

1910 1929

primer <=3'gcggacaaattgtttttgta 5'

II IIIIIII IIIIIIIII ΔG°= -21.4 kcal/mol

(+)duckmdna 5'cgactgtttaccaaaaacat 3'=>

| |

146 165

3402 3420

| |

(-)seaumdna<=3'cgtgaaaacgattt-tccgc 5'

IIIII IIII IIIII ΔG°= -15.7 kcal/mol

primer 5'atgtttttgttaaa aggcg 3'=>

\c/

ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΚΟΛΟΥΘΙΏΝ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΕΝΕΡΓΕΙΑΚΑ ΚΡΙΤHΡΙΑ ΤΩΝ UNIVERSAL PRIMERS

***************************************************************************

* Sequence 1 bee_mdna.seq *

* Sequence 2 bphymdna.seq *

* Sequence 3 drosmdna.seq *

* Sequence 4 duckmdna.seq *

* Sequence 5 flexmdna.seq *

* Sequence 6 gorimdna.seq *

* Sequence 7 humamdna.seq *

* Sequence 8 seaumdna.seq *

* Sequence 9 xenomdna.seq *

***************************************************************************

SEARCH FOR ENERGETICALLY MOST PROFITABLE PRIMING SITES *

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

2848 2873

| |

(-)bphymdna<=3'tatcccaaatgctggagctacaacct 5'

I IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -44.7 kcal/mol

primer 5'aaagggtttacgacctcgatgttgga 3'=>

°

2391 2416

| |

(-)gorimdna<=3'catcccaaatgctggagctacaacct 5'

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -44.7 kcal/mol

primer 5'aaagggtttacgacctcgatgttgga 3'=>

2396 2421

| |

(-)humamdna<=3'tatcccaaatgctggagctacaacct 5'

I IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -44.7 kcal/mol

primer 5'aaagggtttacgacctcgatgttgga 3'=>

4463 4488

| |

(-)xenomdna<=3'ttacccaaatgctggagctacaacct 5'

II IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -43.6 kcal/mol

primer 5'aaagggtttacgacctcgatgttgga 3'=>

642 667

| |

(-)duckmdna<=3'ccccccaaatgctggagctacaacct 5'

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -41.5 kcal/mol

primer 5'aaagggtttacgacctcgatgttgga 3'=>

5575 5599

| |

(-)seaumdna<=3'tttcc-aaacgctggagctacaacct 5'

IIIII III IIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -37.6 kcal/mol

primer 5'aaagg tttacgacctcgatgttgga 3'=>

\g/

primer <=3'aggttgtagctccagcatttgggaaa 5'

IIIIIIIIIIIIIIII II I III ΔG°= -27.8 kcal/mol

(+)drosmdna 5'tccaacatcgaggtcgcaatcttttt 3'=>

| |

7655 7680

primer <=3'aggttgtagctccagcatttg-ggaaa 5'

IIIIIIII II I III III ΔG°= -7.9 kcal/mol

(+)bphymdna 5'tccaacattaagtaaatcaac cctag 3'=>

| \t/ |

2111 2137

c

/ \

primer <=3'aggttgtagctc agcatttgggaaa 5'

IIIIIII II I IIIII III ΔG°= -7.6 kcal/mol

(+)seaumdna 5'tccaacagtaag-ttttaaacatttt 3'=>

| |

5374 5398

· * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

· SEARCH FOR ENERGETICALLY MOST PROFITABLE PRIMING SITES *

· * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

· 2344 2359

· | |

· (-)bphymdna<=3'tttccttgagccgttt 5'

· IIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -32.5 kcal/mol

· primer 5'aaaggaactcggcaaa 3'=>

·

· 122 137

· | |

· (-)duckmdna<=3'tttccttgagccgttt 5'

· IIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -32.5 kcal/mol

· primer 5'aaaggaactcggcaaa 3'=>

·

· 1886 1901

· | |

· (-)gorimdna<=3'tttccttgagccgttt 5'

· IIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -32.5 kcal/mol

· primer 5'aaaggaactcggcaaa 3'=>

·

· 1891 1906

· | |

· (-)humamdna<=3'tttccttgagccgttt 5'

· IIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -32.5 kcal/mol

· primer 5'aaaggaactcggcaaa 3'=>

·

· 5049 5064

· | |

· (-)seaumdna<=3'tttccttgagccgttt 5'

· IIIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -32.5 kcal/mol

· primer 5'aaaggaactcggcaaa 3'=>

·

· 3930 3945

· | |

· (-)xenomdna<=3'cttccttgagccgttt 5'

· IIIIIIIIIIIIIII ΔG°= -31.2 kcal/mol

· primer 5'aaaggaactcggcaaa 3'=>

·

· 122 t 138

· | / \ |

· (-)duckmdna<=3'tttccttgagccg ttt 5'

· IIIIIIIIIIIII III ΔG°= -28.9 kcal/mol

· primer 5'aaaggaactcggc-aaa 3'=>

·

· g

· / \

· primer <=3'aaacggctcaa gaaa 5'

· IIIIIIII II IIII ΔG°= -18.8 kcal/mol

· (+)drosmdna 5'tttgccgaatt-cttt 3'=>

· | |

· 8135 8149

·

· 9525 9539

· | |

· (-)bphymdna<=3'cttcctttgg-cgttt 5'

· IIIIII I IIIII ΔG°= -15.2 kcal/mol

· primer 5'aaaggaactc gcaaa 3'=>

· \g/

· * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

·